NLRP3炎症小体参与真菌性角膜炎固有免疫反应机制的研究

Fungal infection of the eye are important diseases, even with keratoplasty, the prognosis is so poor. And the incidence is raising nowaday in China, while the mechanism is not clear. Recently, the study of NLRP3 inflammasome constitutes a milestone in the innate immunology field, but there is no report about its function in fungal keratitis. Our preliminary study found that NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β pathway was activated in corneal epithelial cells stimulated by Candida albicans. The aim of this study is to investigate the expression of NLRP3 inflammasome family members and the associate molecules in the different grade of fungal keratitis, to analyse the relationship between its expression level and severity of inflammation, and to clarify the mechanism of NLRP3 inflammasome involving in fungal keratitis, even more, to evaluate its downstream cytokines IL-1β and IL-18 expression by inhibiting the exo- or endogenous pathway which involves in NLRP3 inflammasome activation during fungal keratis, in order to change the prognosis of these severe diseases. If achieved, the role of NLRP3 in host anti-fungal defence and inflammatory response during fungal keratitis will be well established. And this study will afford a novel therapeutical benefit in the treatment of fungal keratitis.

真菌性角膜炎是较常见的难治性致盲眼病，发病率在我国有上升趋势，即使联合角膜移植手术，预后仍较差，其发病机制尚不清楚。NLRP3炎症小体是近年固有免疫研究的热点，但有关其在真菌性角膜炎发病过程中作用的研究尚属空白。本组前期实验发现角膜上皮细胞在致病真菌刺激后，NLRP3/ASC/caspase-1炎症小体通路激活，IL-1β产生增加；且相关基因在真菌性角膜炎动物模型表达上调。本研究采用共培养体系和真菌性角膜炎动物模型，系统研究NLRP3相关因子参与真菌性角膜炎发病机理，通过分别阻断NLRP3炎症小体外源性和内源性信号激活通路，判定参与疾病过程中相关的免疫学分子，从宏观和微观角度了解其对疾病进程的作用，为真菌性角膜炎发病机制提供实验依据。同时通过抑制NLRP3炎症小体的活性，减少其相关炎症因子的产生，以降低角膜组织的炎症反应，为真菌性角膜炎的生物治疗提供一种新思路。

感染性角膜病是重要的全球性致盲眼病，是严重的角膜溃疡性疾病，特别是在发展中国家。在我国真菌性角膜炎发生率近年来有上升趋势，特别是随着外伤增多、广谱抗生素和激素的滥用，及角膜接触镜的应用的增多。真菌性角膜炎预后较差，最终多需要角膜抑制，但是术后效果差。因此，深入了解真菌性角膜炎的发生机制，开发新型治疗方法是当务之急。固有免疫系统是角膜组织对抗入侵致病微生物的第一道防线，其通过一系列模式识别受体识别入侵微生物。本项目从原代角膜上皮细胞体外实验和真菌性角膜炎动物模型体内两部分对NLRP3参与真菌性角膜炎的固有机制进行了系统研究，证明了 NLRP3炎症小体参与了真菌性角膜炎发生和发展的固有免疫反应，NLRP3炎症小体在抗真菌感染的过程中发挥了非常重要的作用。本组对真菌性角膜炎动物模型进行基因芯片研究发现， NLRP3炎症小体主要成分在转录水平均有升高，NLRP3升高20.0倍，ASC升高4.5倍，IL-1β和IL-18分别升高136.8、30.2倍。人角膜原代培养人角膜上皮细胞和小鼠真菌性角膜炎的角膜组织中NLRP3和ASC基因和蛋白表达均升高，其调节了caspase-1前体的活化，活性caspase-1通过剪切的方式活化pro-IL-1β，IL-33和pro-IL-18前体， 从而使大量成熟的IL-1β，IL-18和IL-33得以释放，使得感染组织中的这些分子表达均有所增高。这些炎性细胞因子在固有免疫防御的起始、加强等方面有重要作用。对NLRP3炎症小体在真菌性角膜炎发病过程中的活化机制，及其发挥作用的研究，是角膜组织固有免疫反参与抗真菌感染的重要组成部分。进一步，我们通过抑制NLRP3的内源性激活途径（抑制活性氧的产生）、外源性途径（抑制Dectin-1/Syk通路）和直接应用NLRP3的抑制剂，均可以减少NLRP3相关分子的表达降低，从而抑制了真菌感染的角膜组织的炎症反应。综合本课题各部分实验结果，可以证实NLRP3参与真菌性角膜炎的发病机理，为真菌性角膜炎治疗提供新的思路。