Kinesin-12/Myosin-IIB复合物调节神经元生长锥骨架动态重构的功能与机制研究

To enhance the regenerative ability of the central nervous system is always a hotspot in neuroscience. Microtubule cytoskeleton dynamics is essential to the post-injury growth cone dynamic reconstruction and the rapid extension of axon in neuronal regeneration. We found that Kinesin-12，a member of the kinesin superfamily of the microtubule associated molecular motors, interacted and formed a complex with Myosin-IIB, a microfilament-based motor, and regulate cell behavior by associating the microtubule and microfilament cytoskeletons and acting on the dynamics of the cytoskeleton in the transition zone of the growth cone. Our experiment results suggested that these two motor proteins were colocalized in the transition zone of the growth cone and that downregulated expression of kinesin-12 lead to decreased growth cone size and quantity of filopodia, and promote axon extension. Hence, we infer the complex plays an important role in the dynamic reconstruction of the growth cone. In the present study, we shall conduct a research focused on the function of said complex in neurogenesis and post-injury axon regeneration in vivo utilizing zebrafish as a model animal. Initially, we will perform live imaging to observe the function of said complex in the path-finding of the growth cone and the dynamic reconstruction in the growth cone of an injured neuron. Secondly, examine dynamic reconstruction factors including growth cone morphology, axon length and branching in the absence of said complex. Finally, we will dig into the mechanism of its function utilizing point mutation experiments and ultra-resolution microscopy.

提高哺乳动物成体中枢神经损伤再生能力一直是神经科学领域的研究热点。神经元轴突损伤后生长锥的动态重构和轴突的快速推进过程与微管骨架的动态重构关系密切，是影响损伤轴突再生的重要环节。我们发现微管依赖的驱动蛋白Kinesin-12和微丝依赖的马达蛋白Myosin-IIB互作形成复合物，通过联系微管-微丝影响细胞皮质区骨架的动态性调节细胞行为；前期实验表明二者在生长锥转换区存在共定位；下调Kinesin-12表达可减小生长锥面积和丝状伪足数量，促进轴突延伸；由此推测该复合物在生长锥动态重构中发挥调节作用。本项目拟采用斑马鱼模型对此复合物在神经发生和轴突损伤再生过程中的作用机制进行在体研究，动态观察其在生长锥导向过程及损伤轴突顶端生长锥动态重构中的作用，考量此复合物缺失对生长锥形态、轴突长度和分枝等动态重构因素的影响，进而通过磷酸化位点突变与超分辨率成像等实验阐明该复合物影响生长锥动态的分子机制。

脊椎动物KIF15又称kinesin-12，是一个纺锤体相关的微管马达蛋白，其在终末分化的神经元中继续表达，提示该蛋白拥有独立于有丝分裂的功能。与KIF11(脊椎动物kinesin-5)一样，KIF15与轴突中的微管相互作用，以限制它们相对滑行，调整微管骨架重构。在此前的研究中，我们初步检测到Kif15与微丝的马达蛋白Myh10之间存在相互作用，并推测Kif15/Myh10复合物可能影响了神经元轴突的生长与分支。在本研究中，我们制备了Kif15突变体，论证了Kif15/Myh10复合物对发育中的斑马鱼CaP运动神经元和R-B感觉神经元轴突生长起调节作用，发现其功能缺失可以导致斑马鱼胚胎发育中R-B感觉神经元轴突生长显著增加。Kif15/Myh10复合物较多出现在轴突中，Kif15-EGFP和Myh10-mCherry在生长锥处存在共定位现象，提示Kif15和Myh10通过相互结合介导了微管/微丝系统间的相互作用，从而调整生长锥的推进和寻路等行为。以R-B神经轴突为模型，采用双光子激光对R-B感觉神经轴突进行定点定量损伤，发现缺失Kif15/Myh10复合物的运动神经元轴突再生速率显著增加。 在此研究过程中，我们注意到另一个微管相关蛋白fign家族成员对微管行为的作用与Kif15有密切关系，因此我们检测了fign家族基因的表达图式，并且建立了fign家族基因突变体和基因敲降模型，并对其中一个成员fignl2对CaP神经元轴突生长的作用进行了研究，发现fignl2在发育时期的表达显著集中在中枢神经系统，很可能对神经元发育起到调节作用，在胚胎发育至5天时，fignl2的缺失提高了斑马鱼的运动能力，CaP神经元轴突生长速率加快、分支增多的形态学变化，为本课题的后续研究提出了新的切入点。