构建猪SLA-I复合体筛选口蹄疫病毒CTL表位的研究

为了促进动物病毒尤其是近几年一直在世界范围内不断流行的口蹄疫病毒的CTL表位研究，项目申请者根据猪SLA-I类分子体内结合和递呈CTL抗原表位的机理，并借鉴近年来国内外学者相关探索性研究工作，提出了体外构建猪SLA-I复合体，并以此来筛选猪源病毒CTL表位的设想。本研究针对猪A、O和Asia1型口蹄疫病毒，通过克隆和可溶性表达技术体外构建我国主要品系猪SLA-I复合体，然后设计并合成猪各型口蹄疫病毒CTL表位，分别与各品系猪SLA-I复合体体外结合、分离，质谱法筛选可结合的表位，再经过CTL实验验证表位活性，最终建立起猪源病毒CTL表位的筛选系统，并分别筛选出1-2个具有活性的猪A、O和Asia1型口蹄疫病毒CTL表位。本研究将为今后研制口蹄疫生物安全性多表位疫苗奠定基础，并为其它动物病毒CTL表位的研究提供参考。

猪主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）亦称为猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen, SLA），其I类分子与动物的细胞免疫有关。SLA-I包括重链和轻链β2m。SLA-I重链分子包括3个功能基因，分别是SLA-1，SLA-2和SLA-3。其中，SLA-2功能基因与SLA-1和SLA-3在信号肽部位存在明显的差异。本研究利用分子克隆技术克隆了六品系猪SLA-2等位基因，包括SLA-2-YC，SLA-2-DYK，SLA-2-TPK，SLA-2-HB01，SLA-2-YTH和SLA-2-LWH。其中前三个品系猪为国外品系，后三个为国内地方品系猪。其基因序列号目前已经在DDBJ/EMBL/GenBank上发表，对应的序列号为: AB672507，AB672505，AB607801，AB602431，AB672508，AB672506。另外克隆了荷包猪的SLA-I类轻链β2m基因，序列号为AB436775。以六品系猪SLA-2及轻链为目标基因，通过剪接重叠延伸（splicing overlap extension, SOE）PCR方法扩增各品系猪SLA-2-Linker-β2m，并与p2X载体连接，重组质粒转化大肠杆菌TB1，IPTG诱导，SDS-PAGE及Western-blot检测表达蛋白，结果显示6个品系猪均成功表达了SLA-I复合体蛋白，并以融合蛋白MBP-SLA-I（麦芽糖结合蛋白）的形式存在。6品系猪SLA-I蛋白经过纯化、切割、再分离纯化，与合成的口蹄疫病毒多肽在体外进行自然结合，并通过酸洗脱、C-18柱纯化等分离结合多肽，结果证实Q01及QA4能够与多品系猪SLA-I复合体结合。ELISPOT及CTL实验进一步证实Q01及QA4具有细胞杀伤活性。研究得出结论：本研究成功构建了6品系猪SLA-I复合体，并可以在体外筛选口蹄疫或其他猪源病毒多肽；本研究结合CTL实验及ELISPOT实验成功筛选到2类具有功能的口蹄疫病毒CTL表位。