人羊膜间充质干细胞LncRNA ANRIL-miR-125a-APC在种植体周围炎骨缺损修复中的作用与机制研究

Our previous research suggested that human amniotic mesenchymal stem cells (HAMSCs) were able to reverse bone defects induced by peri-implantitis. However, the underlying mechanism remains unclear. According to qRT-PCR analysis, the expression of LncRNA ANRIL was significantly decreased in the process of osteogenesis drove by HAMSCs. Meanwhile, the expression of miR-125a (a MicroRNA which ANRIL acted as a sponge of) was increased and APC (a repressor of Wnt/β-Catenin pathway) expression was decreased. By overexpressing ANRIL, less osteogenesis and lower expression of miR-125a were detected, while the level of APC was dramatic increased. Bioinformatics analysis revealed that binding sites for miR-125a may exist in APC mRNA 3'UTR region. We hypothesize that ANRIL unbinds miR-125a, contributes the combination of miR-125a and APC mRNA 3'UTR region, activates Wnt/β-Catenin pathway and promotes osteogenesis. Our study will demonstrate the hypothesis above according to molecule biology, cytology, and animal experiments. The results may light on the role of LncRNA in new bone formation facilitated by HAMSCs and provide a potential strategy for treating bone defects induced by peri-implantitis.

我们先前研究发现，人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)能够通过促进牙槽骨再生，修复由种植体周围炎导致的骨缺损，但其中的机制未明确。通过qRT-PCR检测,我们发现在此修复过程中，LncRNA ANRIL表达下降，miR-125a表达增高，Wnt/β-Catenin信号通路的负调控因子APC表达下降。过表达ANRIL后发现：成骨分化明显抑制，miR-125a表达明显降低，APC表达明显升高。生物信息学分析发现：APC mRNA的3’UTR区可能存在miR-125a的结合位点。由此我们推测：ANRIL通过解绑被其吸附的miR-125a，使miR-125a与APC mRNA的3’UTR区结合，抑制APC表达，激活Wnt/β-Catenin信号通路，促进成骨分化，增加骨形成。为了验证这一假说，本课题拟从分子、细胞以及动物体内三个层面进行验证，为临床治疗种植体周围炎引起的骨缺损提供新的理论与实验依据。

通过本项目，本课题组证实，HAMSCs能够纠正炎症刺激所引起的HBMSCs成骨分化抑制，而LncRNA ANRIL在这一过程中发挥了重要作用。共培养环境下，HAMSCs首先下调了HBMSCs中ANRIL的表达，其次通过ANRIL的海绵吸附作用，解绑了miR-125a，使其与APC结合，释放β-catenin入核，最终激活Wnt/β-Catenin信号通路，促进HBMSCs成骨。. 颌骨炎症性疾病，如牙周炎或种植周围炎，是引起支持牙槽骨丧失，最终导致口颌功能修复重建失败的最常见原因。目前，基于干细胞的组织再生被认为是一种很有前景的治疗方式。HAMSCs来源于废弃的羊膜组织，具有优越的免疫调节特性和较少的伦理争议。因此，本研究探讨了HAMSCs对于炎症刺激条件下HBMSCs成骨分化的作用及潜在的机制。首先，与HAMSCs进行共培养后，LPS引起的HBMSCs成骨分化抑制被纠正、氧化应激水平则明显减轻，而这些表型变化都与HBMSCs中ANRIL的进行性表达降低存在着高度的一致性。接下来，本研究对ANRIL进行了重点关注。体内和体外的结果显示，HBMSCsANRIL抵消了HAMSCs对于炎症刺激HBMSCs成骨分化的纠正作用，而HBMSCsshANRIL则增强了HAMSCs的效果。为了进一步研究ANRIL的作用机制，我们验证了ANRIL和miR-125a的结合位点，并证实了ANRIL下调能够解绑其海绵吸附的miR-125a，而miR-125a的表达对于HBMSCs成骨分化具有正向调节的作用。在明确了ANRIL/miR-125a轴的功能后，我们将关注点聚焦于miR-125a的作用靶点上。APC在Wnt/β-catenin通路中起负调控作用，能够抑制β-catenin核移位。我们验证了miR-125a能够与APC的3'-UTR结合，抑制其表达，从而释放β-catenin，促使其入核，激活Wnt/β-catenin通路。此外，挽救实验也表明，shANRIL和miR-125a inhibitor共转染可上调APC表达，部分抑制HAMSCs促进的成骨分化。综上所述，本研究从HAMSCs促进炎症刺激HBMSCs成骨分化这一现象入手，以LncRNA ANRIL作为切入点和突破口，层层递进、逐层深入，为颌骨炎症性疾病的的治疗提供了新的靶点和理论实验依据。