诱发遗传性心脏综合征的人PRKAG2基因新突变的功能研究

研究认为，腺苷一磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）活性受其γ2 亚基编码基因(PRKAG2)调节。新近资料表明，家族性心肌肥厚合并传导系统异常及心室预激家系的主要发病机制系PRKAG2基因突变致AMPK活性失调导致心脏糖原沉积，从而产生多种复杂的心脏病变。目前国外家系中发现的9种突变都集中于PRKAG2基因的胱硫醚β-合成酶（CBS）区域。我们在前期工作中调查了一个汉族人PRKAG2心脏综合征大家系，临床表型符合国外家系的共性，在患病成员的PRKAG2基因非CBS区域外显子3上发现了一个新的错义突变G100S，本课题拟通过在CCL13细胞和斑马鱼中过表达PRKAG2突变基因研究G100S突变对基因表达、AMPK活性、糖原代谢、胚胎心脏发育过程的影响，考察PRKAG2 G100S新突变的功能。本项目可以为探讨汉族人家系的发病机制提供新线索，加深对PRKAG2基因非CBS区域的功能了解。

本课题采用PCR技术体外合成了全长PRKAG2基因，并对预期突变位点G100S、R302Q行定点突变，成功构建了慢病毒表达质粒，在国内首次建立了过表达野生型及G100S、R302Q突变型PRKAG2基因的CCL13细胞模型。通过蛋白印迹、免疫荧光、MTT检测、PAS染色、ELISA法等分子生物学实验技术，体外研究发现PRKAG2 G100S突变使CCL13细胞中PRKAG2蛋白表达减少，糖原沉积增多，AMPK活性降低，而对细胞生长及亚细胞内定位没有影响。本课题同时克隆了斑马鱼心肌特异性vmhc启动子基因功能片段序列，应用显微注射技术将该启动子驱动的PRKAG2野生型及突变型基因片段成功导入斑马鱼受精卵，在国内首次构建了过表达G100S和R302Q突变型PRKAG2基因的斑马鱼心脏肥厚模型。通过real-timePCR验证PRKAG2基因表达，Western Blot验证PRKAG2蛋白表达，PAS染色检测心肌糖原含量，比色法定量检测AMPK活性，体内研究证实了G100S突变导致PRKAG2基因功能发生了与体外实验研究结果一致的变化。. 本课题通过体外研究和体内研究初步证实PRKAG2 G100S突变导致PRKAG2分子生物学活性发生变化，阐明了PRKAG2 G100S突变导致AMPK活性降低及糖原累积是中国人PRKAG2心脏综合征家系的发病机制，证实了G100S突变基因型与临床表型之间的因果关系。研究结果表明位于PRKAG2基因非CBS区域的G100S突变与CBS区域的R302Q突变对PRKAG2基因和蛋白表达的影响相似，但弱于后者，导致AMPK活性下降及心脏肥厚的程度也均弱于后者，说明G100S和R302Q对AMPK活性调节的机制可能是一致的，G100S突变也可能作用于Bateman结构域，损害了Bateman结构域结合AMP的能力，但位于PRKAG2基因非CBS区的G100S突变所导致的基因生物学效应弱于位于CBS区的突变，提示我们非CBS区对PRKAG2基因功能的影响可能弱于CBS区。