氯离子通道阻滞剂NPPB在青光眼滤过泡瘢痕化中的作用及机制研究

Filtration surgery is the main operation method to treat glaucoma, but the 5 years survival rate of filtering bleb is less than 50%. involved in the filtering bleb scarring process of glaucoma filtration surgery by Conjunctival fibroblasts differentiation，proliferation, migration, extracellular matrix (ECM) synthesis and collagen contraction which lead to filtering bleb scarring is the main main cause of surgery failure. Our previous studies have confirmed that CLC-2 chloride channel regulated the differentiation, proliferation, migration, extracellular matrix (ECM) of HconF via PI3K/Akt signaling pathways. A number of studies have found that chloride channel blocker NPPB involved in the process of cell proliferation, migration and cell cycle progression in a variety of cell type. In this topic various methods (Molecular biology, flow cytometry, cell wound scratch assay, Transwell migration assay method) would be used to investigate the effect of NPPB on differentiatio, proliferation, migration, ECM synthesis and collagen contraction of human conjunctival fibroblasts. Then we would build rat glaucoma filtration surgery model to analyze the effect of CLC-2 siRNA and NPPB on scarring processes of filtering bleb after glaucoma filtration surgery. And further explore the signaling pathways by which NPPB regulate the scarring processes of filtering bleb to provide new targets for anti filtering bleb scarring.

滤过性手术是治疗青光眼的主要手术方式，但术后5年滤过泡存活率不超过50%。其失败的原因是结膜成纤维细胞（HconF）通过分化、增殖、迁移、ECM合成及胶原收缩导致滤过泡瘢痕形成。研究表明氯离子通道阻滞剂NPPB抑制多种细胞增殖、迁移和细胞周期进展，目前还没有通过阻滞氯离子通道而抗滤过泡瘢痕化的研究。我们前期研究发现CLC-2氯离子通道通过PI3K/Akt信号通路调控HconF细胞纤维化过程。本课题将在前期工作的基础上，拟采用分子生物学、流式细胞仪、迁移等实验方法研究NPPB在HconF细胞纤维化中作用及其机制；建立SD大鼠青光眼滤过手术模型，观察CLC-2氯离子通道的表达；用siRNA-CLC-2和NPPB抑制大鼠结膜CLC-2氯离子通道的表达，检测各项瘢痕化指标，阐明CLC-2氯离子通道在青光眼滤过泡瘢痕化中的作用，为青光眼抗滤过泡瘢痕化治疗提供新靶点。

青光眼滤过手术以其显著的降眼压效果占据目前青光眼手术方式的主流，滤过泡瘢痕化是影响滤过手术成功率的主要原因，尽管抗代谢药物丝裂霉素 C(MMC)和5 氟尿嘧啶(5-FU)的应用提高了手术的成功率，但是这些药物的毒副作用也是有目共睹的,近年来，有研究发现阻断氯离子通道后，可通过抑制肺成纤维细胞胶原合成及胶原收缩抑制肺纤维化过程；也有研究证实，受伤表皮前缘局部CIC-3表达的增强与伤口闭合有关，提示CIC-3参与了伤口愈合过程。关于氯离子通道在青光眼滤过泡瘢痕化中的作用尚待研究。本课题在TGF-β1诱导的基础上，分别用CLC-2 siRNA及氯离子通道阻滞剂NPPB阻断CLC-2氯离子通道，观察发现阻断CLC-2氯离子通道后TGF-β1诱导的人结膜成纤维细胞（HconF） 细胞增殖细胞周期进展细胞分化细胞迁移及胶原收缩等纤维化过程均受到抑制，研究发现细胞外基质蛋白酶及蛋白酶抑制剂的动态平衡被打破，从而引起细胞外基质Collagen-I、Fibronectin表达减少，通过检测PI3K/Akt表达发现CLC-2氯离子通道可能通过PI3K/Akt信号通路调控HconF 细胞纤维化。为验证细胞实验的结果，进一步建立 SD 大鼠青光眼滤过手术模型，术后结膜下注射不同浓度NPPB，发现适当浓度的NPPB可增加滤过泡面积、延长滤过泡存活时间，维持更低的术后眼压， HE 染色观察见NPPB干预可减少滤过泡区炎症细胞浸润、新生血管及胶原纤维形成，检测滤过泡区瘢痕化相关指标表达，结果显示NPPB可抑制滤过泡区细胞外基质Collagen-I、Fibronectin合成，进一步研究发现NPPB抑制细胞外基质合成的分子机制是MMP/TIMP的的动态平衡被打破，NBBP还抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，从而抑制滤过泡瘢痕化，延长滤过泡存活时间，维持滤过术后眼压稳定，为提高青光眼滤过手术成功率提供了一个新途径。