磁螺菌硝酸还原酶操纵子调控机制及在生物矿化中的作用

Magnetotactic bacteria are very important model organisms for bacterial biomineralization and appealed great interests for both research and application. Until now, the biosynthetic mechanism of magntosomes is still unknown. In past decades, researchers have focused most of their attention on genes in magnetosome islands. However, genes outside the island also play key roles during biomineralization..Recently, the complete genomic sequence and four transcriptomes of Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 were analyzed by our group. Surprisingly, when magnetosome appeared in MSR-1 cells, the expression of some denitrification genes was obviously up regulated, such as periplasmic nitrate reductase (nap) operon, a napC homologous gene (MGMSRv2_2833), and a gene involved nitrite reduction (nirT)..In this work, the mechanism of FNR-mediated oxygen-responsive regulation of the nap operon would be investigated by Electrophoretic Mobility Shift Assay, Chromatin immunoprecipitation, and DNA footprinting, as we found two fnr homologous genes (MGMSRv2_2046 and MGMSRv2_2946) in MSR-1 genome and also their binding site at the upstream of nap operon. The effects of FNR regulation would be estimated by constructing mutant strains by double cross-over gene replacement. The functions of key genes in denitrification pathway (napF, napA, napC, nirT, MGMSRv2_2833) would be analyzed by the same mutation method, respectively. The results would not only show the differences of denitrification pathways between magnetotactic bacteria and non-magnetotactic bacteria, but also relationship between nap operon and magnetosome biosynthesis.

趋磁细菌及其生物矿化的研究具有重要的理论价值和广泛的应用前景，但以往的工作多集中于磁小体岛内基因，对岛外基因的研究较少。.本实验室最近完成了磁螺菌MSR-1的全基因组和转录组的分析，发现在磁小体生物合成的时期，与反硝化作用相关的一些基因的转录水平增加。特别是硝酸还原酶(nap)操纵子、napC同源的MGMSRv2_2833基因、参与亚硝酸还原的nirT基因等显著上调。.本研究拟以磁螺菌(MSR-1)为材料，采用EMSA、CHIP、DNA Printing等方法，探讨该菌两个与FNR同源的氧调节蛋白对nap操纵子的调控机制；通过同源双交换，构建缺失突变株，分析调节效果，以及主要的nap基因与nirT、MGMSRv2_2833等的功能，明确这些基因的特征及其对细胞生物矿化和反硝化作用的影响。研究结果，不仅可揭示趋磁细菌反硝化过程的特异性, 同时可阐明nap操纵子及其调控与磁小体合成的关系。

背景：趋磁细菌及其生物矿化的研究具有重要的理论价值和广泛的应用前景，但以往的工作多集中于磁小体岛内基因，对岛外基因的研究较少。在前期工作中，我们发现在磁小体生物合成的时期，一些与反硝化作用相关基因的转录水平大幅度上调，说明趋磁细菌的反硝化作用与磁小体的生物矿化有密切的联系。.内容：本研究试图揭示趋磁细菌中反硝化操纵子(nap)的调控机制，以及反硝化作用与磁小体合成的关系。通过转录组分析，在磁螺菌(MSR-1)中，除了先期报道中推测的调控反硝化作用的氧调节蛋白MgFnr，我们又发现了一个新的调控蛋白Mg2046。采用EMSA、CHIP、DNA Printing等方法，探讨这两个与反硝化作用相关蛋白对nap操纵子的调控机制；通过同源双交换、构建缺失突变株，分析调节效果，以及反硝化作用对细胞生物矿化的影响。.结果：(1)与研究较多的假单胞菌的反硝化调控模式，以及我们的预想相反，在磁螺菌MSR-1中，直接调控反硝化操纵子的是Mg2046，MgFnr是其上一级调控蛋白，而且MgFnr还同时调控磁小体合成最大也是最关键的基因簇mamAB的转录。(2)在培养基中没有硝酸盐时，MSR-1也可以低水平地表达反硝化途径，并以此为基础产生少量的一氧化氮，而且随着溶氧的降低，一氧化氮在培养基中的浓度也呈上升趋势。一氧化氮是个气体信号分子，在真核生物中可调节众多的生物学过程，最近发现一氧化氮在细菌中也起着重要的调控作用。我们在MSR-1找到了两个一氧化氮的受体蛋白：NsrR1和NsrR2。前者的突变导致磁小体合成受阻，后者的突变可以使大部分磁小体的粒径降低。.意义：(1)初步揭示了磁螺菌MSR-1反硝化作用调控的分子机制；(2)首次发现有直接实验证据的、且直接调控磁小体岛基因转录的调控因子；(3)发现了一种新的细菌合成一氧化氮的途径；(4)首次揭示了一氧化氮调控生物矿化的机制。