纳米氧化铜在Caco-2细胞和鸡消化道吸收转运方式研究

The possibility and way of the copper oxide nanoparticles into cells in the form of particles is observed by Caco-2 endocytosis inhibition test. To explore the possibility of absorption and transport of the copper oxide nanoparticles in the form of Cu+, the effect of Cu+ specific chelating agent on absorption and transport of copper oxide nanoparticles in Caco-2 cell model is studied through application of Transwell experimental method. By Western Blot method, to study the effect of different copper sources on Ctr1, ATP7A, ATP7B, MT and DMT1 expression of protein in Caco-2 cells, according to the strength of regulate and control, deduce the specificity of absorption and transport of copper oxide nanoparticles. The copper oxide nanoparticles absorption kinetics parameters is studied in the crop, the proventriculus and the small intestine comparatively. Through application of the crop, proventriculus and small intestine perfusion technique, transmission electron microscopy and X photoelectron spectroscopy, copper oxide nanoparticles distribution in the epithelium of the digestive tract is observed. The effect of different levels of copper oxide nanoparticles, copper oxide and copper sulfate on the digestive tract Ctr1, ATP7A, ATP7B, MT and DMT1 mRNA and protein expression in chicken is studied. The best absorption site of copper oxide nanoparticles in the digestive tract and the absorption and transport mode is confirmed. The mechanism of absorption and transport of copper oxide nanoparticles is clarified from molecular,cell and organ level.

通过Caco-2细胞内吞抑制试验，探讨纳米氧化铜以颗粒形式进入细胞可能性与途径；运用Transwell实验方法，观察Cu+特异性螯合剂对纳米氧化铜在Caco-2细胞模型上吸收转运的影响，探讨其以Cu+吸收转运的可能性；用Western Blot方法检测不同铜源对Caco-2细胞中Ctr1、ATP7A、ATP7B、MT和DMT1蛋白表达量的影响，根据调控强度，推断纳米氧化铜吸收转运的特殊性。比较研究纳米氧化铜在鸡的嗉囊、腺胃和小肠吸收动力学指标；采用嗉囊、腺胃和小肠灌注技术、透射电镜技术和X光电子能谱技术,观察氧化铜纳米颗粒在消化道粘膜上皮的分布状况；比较不同水平纳米氧化铜、微米氧化铜和硫酸铜对鸡消化道Ctr1、ATP7A、ATP7B、MT和DMT1 mRNA及蛋白表达的影响，推断纳米氧化铜在消化道的最佳吸收部位及吸收转运方式。从分子、细胞和器官水平上探讨纳米氧化铜吸收转运机制。

铜是畜禽必需的微量元素，在饲料中添加硫酸铜是传统的补铜方法，由于硫酸铜吸收利用率较低，随着动物粪便排放而污染环境。进一步探寻提高铜吸收利用效率的新型铜源化合物，具有重要的意义。本实验室前期研究发现，鸡对纳米氧化铜的表观消化利用率高于硫酸铜，对鸡的生物学活性也显著高于硫酸铜。但是，对于纳米氧化铜在消化道吸收转运的方式不是十分清楚。本研究旨在通过建立Caco-2细胞单细胞层模型，研究内吞抑制剂对纳米氧化铜转运的影响、不同铜源化合物（硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜）对Caco-2细胞Ctr1、ATP7A、ATP7B、MT、DMT1 mRNA相对表达量及其蛋白表达量的影响、一价铜离子特异性螯合剂（BCS）和一价铜离子特异性螯合剂（EDTO）对纳米氧化铜在Caco-2单细胞层模型上吸收转运的影响；通过动物试验，比较研究纳米氧化铜在鸡嗉囊、腺胃和小肠的吸收动力学、氧化铜纳米颗粒在消化道粘膜上皮的分布状况、纳米氧化铜对鸡嗉囊、腺胃和小肠Ctr1、Ctr2、ATP7A、ATP7B、MT和DMT1 mRNA及蛋白表达的影响。研究发现，纳米氧化铜颗粒可以通过细胞内吞途径进入Caco-2细胞，而且纳米氧化铜颗粒进入细胞是由多种内吞途径共同完成。观察Caco-2细胞中铜转运蛋白基因和蛋白表达量的变化，证明纳米氧化铜能够以铜离子的方式被吸收转运。进一步证明纳米氧化铜是以一价铜离子和二价铜离子两种形式被细胞吸收转运。动物试验发现，纳米氧化铜在嗉囊、腺胃、小肠的吸收速率高于硫酸铜、微米氧化铜，纳米氧氧化铜的消化利用率高于硫酸铜、微米氧化铜。在鸡嗉囊、腺胃、十二指肠、空肠粘膜上皮细胞均有纳米氧化铜颗粒。观察纳米氧化铜对消化道铜转运蛋白基因与蛋白表达的影响，发现纳米氧化铜也可以以铜离子方式在消化道吸收转运。阐明了纳米氧化铜是以一价铜离子、二价铜离子和纳米氧化铜粒子内吞方式等多种途径被细胞吸收转运，整个转运过程受到多种铜离子转运蛋白及多条细胞内吞途径的协同调控。该发现，对于纳米氧化铜在饲料生产中广泛应用提供重要理论依据，具有重要的科学指导意义。