中华蜜蜂气味受体基因Or1、Or2的表达、定位与功能研究

Based on our previous research in odorant receptors AcOr1,AcOr2 in Apis cerana cerana, we intend to study the expression characteristics of the two genes in depth and investigate their function in olfactory recognition. Analysing mRNA expresion pattern of drones on different development stages by qRT-PCR and contrasting to that of workers obtained in our previous study. Locating of AcOr1 and AcOr2 in antenna by in siu hybridization and immunohistochemistry to invitagate their expression differences and the potential functions of mRNA and proteins between workers and drones. Silencing the two genes in vivo using RNA interference to detect the inhibition effect and to analyze their interactions. Measuring the electro- phsiological responses of antennae to diverse odors between test and control groups uning electroantennogram (EAG) to analyze the odorant binding characteristics of the two odorant receptors. This project can provide the molecular bases for further study on the specific odorant receptors in A. cerana cerana, and a breakthrough on olfactory recongnition mechanism of honeybees can be expected.

本项目基于我们对中华蜜蜂工蜂气味受体基因AcOr1、AcOr2的前期研究工作（AcOr1为传统气味受体基因，AcOr2为DOr83b直向同源基因），进一步对这两个基因的表达特征进行深入研究，并对其功能进行探索。用qRT-PCR研究雄蜂不同发育阶段两目的基因的表达谱，并与已研究的工蜂的表达特征进行对比。用原位杂交和免疫组化方法对两个目的基因进行定位，分析其mRNA及其蛋白在不同性别中蜂中的表达差异，推测其潜在功能。通过RNAi技术分别抑制AcOr1、AcOr2在活体中的表达，并用qRT-PCR及原位杂交等方法对抑制后的效果进行检测，同时分析两基因间的互作效应。用触角电位仪对干扰组和对照组雌／雄成虫触角对不同气味物质的电生理反应进行测定，分析两气味受体的气味结合特点。本项目可为进一步研究中华蜜蜂特异性气味受体的功能提供分子依据，可望在蜜蜂嗅觉识别蜜粉源机理的研究方面取得新的突破。

昆虫的嗅觉系统是一个高度专一、极其灵敏的化学监测器，能识别环境中特异的化学气味分子。昆虫气味受体（ORs）作为嗅觉系统的成分之一，在气味识别及嗅觉信号传导过程中起到了关键的作用。该项目主要对中华蜜蜂气味受体基因Or1、Or2的时空表达进行了分析，对其功能进行了初步探索，获得了大量的有参考价值的实验数据。荧光定量检测结果表明，Or1、Or2在雄蜂触角中的表达量随个体发育逐渐增高。根据两基因的cDNA序列设计合成多肽段，制备多克隆抗体，利用Western blot技术对两蛋白在内勤蜂和采集蜂各组织中蛋白的相对表达情况进行研究。结果显示，Or1均在内勤蜂和采集蜂的胸部表达最多，而Or2则主要集中在头部表达。通过原位杂交与免疫组化技术对两气味受体基因在工蜂触角中蛋白的表达进行定位分析。结果表明，Or1主要在靠近触角底膜的板形感器的神经元细胞中表达，而Or2在板形感器和毛形感器中均有表达，这与Or2的共受体身份和功能相对应。通过饲喂的方式建立了Or1 dsRNA干扰体系，采用qRT-PCR和Western blot检测干扰效果。结果显示，饲喂dsRNA后Or1的表达量受到一定程度得抑制，且饲喂后第2 d和第5 d时RNA水平干扰效果最佳，而蛋白水平则在饲喂后3 d干扰效果最佳。将Or1、Or2转染至异源细胞Sf9中，荧光检测结果表明两气味受体均在细胞膜上表达，且在转染48 h后的表达量最高。本项目的实施为进一步研究中华蜜蜂特异性气味受体的功能及其嗅觉识别机制方面提供了新的分子依据。