血管内皮细胞NLRP3炎性小体调控NETs诱发重症中暑DIC作用机制研究

DIC is one of the important mechanism of severe heatstroke-induced MODS, which endovascular microthrombus is due to the interaction between vascular endothelium and PMNS is a key start. PMNs can be activated and release NETs to induce the immunothrombosis. Our previous study discovered that NLRP3 inflammasome participated in the pathogenesis of severe heatstroke and NLRP3 inflammasome of vascular endothelial cell was positively associated with NETs formation. It is seldom explored that whether NLRP3 inflammasome in the vascular endothelial cells participated in the NETs regulation and induce DIC in severe heatstroke. It was hypothesized in our study that NLRP3 inflammasome positively regulated the formation of NETs to induce immunothrombosis and DIC initiation. In our study, the effect of NETs on the pathogenesis of severe heatstroke-induced DIC were observed through PMNs exhaustion, NETs inhibition, NLRP3 gene knock-out and SiRNA interference in the severe heatstroke mice and heat-stress cellular model. The pathogenesis of NLRP3 inflammasome-NETs- immunothrombosis-DIC will be illuminated in severe heatstroke.

弥散性血管内凝血（DIC）是重症中暑MODS发生的重要机制之一，血管内微血栓形成是启动DIC的关键环节，基于血管内皮和中性粒细胞（PMNs）相互作用致免疫性血栓失控是重要因素之一。研究表明重症中暑PMNs激活可释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成免疫性血栓。我们前期发现NLRP3炎性小体参与重症中暑发病机制，血管内皮细胞NLRP3炎性小体参与NETs生成的正向调控。但血管内皮细胞NLRP3炎性小体是否参与调控NETs进而诱导重症中暑DIC发生目前未见报道。因此我们提出假设：重症中暑血管内皮细胞NLRP3炎性小体正向调控NETs生成诱发免疫血栓形成，进而启动DIC发生。本研究拟在复制重症中暑小鼠模型和热应激细胞模型基础上，采用PMNs耗竭、NETs抑制剂、NLRP3基因敲除和SiRNA干扰等方法，初步阐明重症中暑血管内皮细胞NLRP3炎性小体-NETs-免疫血栓-DIC发生机制。

DIC是导致重症中暑多脏器功能衰竭和预后不良的重要因素。本研究从机体热应激启动免疫反应和过度凝血反应角度出发，观察中性粒细胞释放NETs在免疫性血栓形成和放大，并最终导致微循环障碍和凝血紊乱中的作用并探索分子机制。结果显示：1、通过重症中暑DIC小鼠模型，明确了重症中暑DIC凝血紊乱的指标演变，即热打击过程中出现以全血凝血指标CR增高的短暂性高凝状态，重症中暑模型复制成功后出现逐渐加重的低凝状态，24h达最高峰，且合并血小板功能低下的DIC消耗性低凝状态，存活小鼠72h可自行恢复；2、重症中暑患者血清NETs标记物MPO、DsDNA和citH3水平显著升高，与DIC评分密切相关，免疫荧光提示重症中暑DIC患者血清可刺激正常人分离中性粒细胞释放NETs；复制重症中暑DIC小鼠模型，发现通过抑制NETs生成和清除NETs，可减轻重症中暑小鼠的低凝状态，病理检查发现微血栓形成明显减轻，肝肾功能损伤程度减轻；表明NETs释放参与了重症中暑DIC的病理生理过程；3、通过Luminex多细胞因子检测，发现重症中暑合并DIC 时血清凝血相关因子包括IL-6、MMP-8、IL-1β、血小板反应蛋白（Thrombospondin）、VCAM-1、ICAM-1及HMGB1均显著性升高，结合文献和前期研究，发现HMGB1在重症中暑早期升高最显著，可能是继发上述免疫性血栓形成的启动因子；4、通过在动物水平抑制HMGB1的活性，发现DIC小鼠的低凝状态和肝肾功能明显改善，提示HMGB1可能参与了重症中暑DIC的过程；5、通过体外Flow Chamber实验显示，HMGB1可以直接激活PMNs释放NETs；通过HMGB1抑制的体外实验，显示HMGB1可激活内皮细胞NLRP3炎性小体并释放IL-1β等炎症因子同时造成内皮细胞损伤；通过Transwell 中性粒细胞和内皮细胞共培养热打击研究，发现中和IL-1β可显著降低培养液中citH3和dsDNA水平。结果表明HMGBI可通过直接效应或激活内皮细胞NLRP3炎性小体/IL-1β途径促进中性粒细胞NETs释放，从而启动和放大免疫性血栓形成，是重症中暑DIC的免疫学机制。该研究从过度免疫反应角度探索了重症中暑并发DIC的机制，为重症中暑DIC的早期治疗提供了新的靶点，有利于早期阻断重症中暑多脏器功能衰竭的进程和降低死亡率。