苏云金杆菌伴胞晶体杀虫作用中昆虫抗性产生的分子机制

苏云金杆菌伴胞晶体主要含有原毒素与20-kb DNA组成的复合物，而靶标昆虫中肠道内DNase表达量的变化对于晶体的杀虫毒力及昆虫抗性发生的影响还未见有报道。本项目将构建枞色卷蛾中肠组织的cDNA文库，从中获得中肠DNase基因的cDNA序列。分析枞色卷蛾不同发育时期DNase表达量的差异，并对Bt敏感和抗性品系中肠道内DNase表达量及其cDNA序列进行比较分析。同时采用RNA干扰技术使敏感枞色卷蛾的DNase基因沉默表达，获得DNase表达缺失的品系。检测在DNase表达出现差异或缺失的情况下，原毒素和20-kb DNA在激活过程中的动态变化，并分析DNase表达量的变化对Bt伴胞晶体杀虫毒力的影响。本项目将阐明DNase在昆虫产生Bt抗性中的作用，进一步揭示Bt晶体中20-kb DNA在原毒素激活和杀虫过程中的功能，为害虫抗性管理提供新的策略。

本项目基本上取得了预期的研究成果，已在国外SCI源期刊上发表研究论文2篇，另有3篇论文整理完成，准备投往国外SCI源期刊。目前培养在读研究生5名。取得的成果主要有：.1. 构建了Bt伴胞晶体中20-kb DNA与原毒素复合体的分子模型，其中每个原毒素分子与DNA双链骨架存在三个结合区域，其中两个区域为特异性结合，结合区位于20-kb DNAs的大沟处，另一个非特异性结合区域位于DNA的小沟处。复合体的接触面为1664.60 nm2，能量为70.68 kcal/mol。通过这种方式，多个原毒素分子与20-kb DNA的骨架结合，而不同复合物中DNA的序列各有不同。.2. 发现鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）中肠组织DNase为具有非限制性内切酶和外切酶活性的脱氧核糖核酸酶，对原毒素-DNA复合物中的DNA片段具有降解作用。该DNase在三龄幼虫时表达量最低，在蚁蚕及五龄幼虫时表达量较高。.3. 对枞色卷蛾（Choristoneura fumiferana）中肠组织CF-203细胞系的质膜进行蛋白质组分析，鉴定到682个非冗余蛋白，其中质膜蛋白90个，为筛选新型杀虫活性物质提供了重要基础。.4. 利用激光共聚焦显微镜对Bt中原毒素与基因组DNA片段的相互结合过程进行实时检测，揭示了Bt原毒素的表达特征及其与基因组DNA的结合过程。.5. 在Bt杰加森亚种（Bt subsp. jegathesan）中检测到3种新毒素（Cry30Ca、Cry60Aa和Cry60Ba），其编码基因表现出cry30Ca-gap-orf2和cry60Ba-gap-cry60Aa的结构。Cry60Aa和Cry60Ba对致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）具有杀虫活性，而Cry30Ca则对其无毒力。.6. 发现Cry11Aa毒素的结构域II和Cry11Ba的结构域I对于毒素稳定性具有重要作用，Cry11Ba的3个结构域共存对其毒力具有决定作用，而Cry11Aa的结构域III可以被Cry11Ba的结构域III替换而不影响Cry11Aa的毒力。.7. 在Bt 4.0718菌株中发现了枯草芽胞杆菌嗜食行为3个关键操纵子sdpABC、sdpRI和skf的同源序列，正在对其进行功能鉴定。此外发现Cry1Ac原毒素C端区域Cys残基的单点突变对晶体形成无明显影响。