番木瓜环斑病毒多功能蛋白HC-Pro与寄主钙网蛋白互作的分子机制研究

HC-Pro是番木瓜种植业毁灭性病害番木瓜环斑病毒(PRSV)病毒蛋白中功能最多、最复杂的。申请者利用酵母双杂交、植物体内和体外互作实验从番木瓜cDNA文库中筛证出1个与PRSV-HC-Pro互作的Ca2+结合蛋白-钙网蛋白PaCRT，具有高Ca2+结合能力的C-domain是与HC-Pro互作的必须结构域；PaCRT mRNA表达在PRSV侵染番木瓜植株初期受到诱导上调。为了探究HC-Pro/PaCRT互作分子机制，本项目拟对PaCRT和 HC-Pro进行亚细胞定位和共定位，并分别应用转基因过量表达和番木瓜花叶病毒诱导沉默(VIGS)PaCRT基因，通过比较PaCRT基因上调和下调表达对PRSV侵染能力、HC-Pro亚细胞定位及细胞内Ca2+浓度的影响，解析HC-Pro/PaCRT互作分子机制和Ca2+信号在PRSV侵染和植物防御中的生物学功能，为防治PRSV新策略提供科学依据。

番木瓜环斑病毒（PRSV）是热带、亚热带地区的毁灭性严重病害。前期申请人从番木瓜cDNA文库中筛证出1个与PRSV-HC-Pro互作的Ca2+结合蛋白-钙网蛋白（PaCRT），具有高Ca2+结合能力的C-domain（307-422 Aa）是与HC-Pro互作的必须结构域。PaCRT mRNA表达在PRSV侵染番木瓜植株初期受到诱导上调。为了探究HC-Pro与PaCRT互作在PRSV侵染或植物防御过程中的分子机制，本项目建立了番木瓜叶片原生质体GFP瞬时表达系统，在此基础上利用双分子荧光互补（BiFC）方法亚细胞定位了HC-Pro与PaCRT的互作发生在胞间连丝。为了研究PaCRT基因表达的变化对PRSV积累和侵染能力的影响，首先利用农杆菌介导的番木瓜遗传转化，分别获得了过量表达PaCRT，PaCRT（307-422 Aa），烟草NtCRT，NtCRT（283-389 Aa）的4种转基因番木瓜植株；同时，利用番木瓜花叶病毒诱导基因沉默（PaMV-VIGS）系统得到PaCRT基因被下调表达的番木瓜植株。然后分别将PRSV接种到过量表达CRT转基因番木瓜植株和发生PaCRT沉默效应植株，观察致病表型，并采用qRT-PCR比较分析PRSV积累情况，结果表明：CRT基因的过量表达可以抑制病毒积累，而下调表达则促进了病毒的积累和侵染，接种PRSV10d后，过量表达CRT基因植株的病症相对于野生型较轻，CRT基因被下调表达的植株的病症相对于野生型明显严重。由于植物CRT具有高Ca2+结合能力，PaCRT的C-domain（307-422 Aa）是与HC-Pro互作的必须结构域，本项目利用Fluo-4 Calcium Assay 分析了4种过量表达CRT基因和PaCRT基因被下调表达的番木瓜叶片原生质体中Ca2+浓度的变化，结果显示在过量表达CRT原生质体中的Ca2+浓度明显大于野生型对照和PaCRT基因被下调表达的原生质体中的Ca2+浓度，而PaCRT基因被下调表达的番木瓜叶片中的Ca2+浓度要比野生型对照原生质体中的Ca2+浓度低。综上所述，过量表达PaCRT增加了细胞内Ca2+的贮存，从而可能激发了Ca2+信号介导的植物防御途径以提高植物对PRSV防御能力，而HC-Pro与PaCRT的互作可能影响了PaCRT介导的Ca2+信号转导通路，从而干扰了植物对PRSV的防御。