环化提高抗菌肽抗菌活性的机制研究

抗菌肽在医药、畜牧、食品等领域显示了巨大的应用潜力，特别是最近发现的环肽，相对于普通的线性肽有诸多的优点。研究表明环化可增加肽的生物学活性，但对其机理还无法解释。内含肽介导的多肽环化技术为抗菌肽的环化研究提供了新思路。本实验室已利用蓝细菌DnaE内含肽转剪接特性，建立了多肽环化的平台。本研究拟选取氨基端和羧基端较接近的菌丝霉素（Plectasin）和乳铁蛋白抗菌肽(Lactoferricin B)等5个抗真菌肽和氨基端和羧基端相距较远的PW2抗菌肽为目标肽，该六种抗菌肽具有较强的抗菌活性。利用内含肽介导的环化技术对选定六种抗菌肽进行环化研究，通过比较环化前后抗菌肽抗菌活性和稳定性的变化，对环肽进行结构解析，研究环化结构与其功能间的关系，探讨环化提高抗菌肽抗菌作用的机制。

内含肽介导的蛋白质环化是在内含肽的作用下，蛋白质的N端和C端生成一个天然的肽键，达到蛋白质环化的目的。环化可以减小蛋白质构象的熵值，使蛋白质更加稳定。蛋白环化为生产稳定药物蛋白质和工业酶提供了一种新的手段。环化的蛋白和肽不仅可以提高蛋白的稳定性，而且还可以提高蛋白的活性，减少蛋白的构象柔性。许多生物可以自身合成环形的抗微生物肽，这些环肽可在体内构建，可以与细胞内环境兼容，还可抵抗蛋白水解。环化肽和蛋白的新技术可以极大的促进蛋白结构、功能关系的研究，也可以有效的设计新的酶和药物。. 抗菌肽是一类小的、进化保守、带正电的两性分子。抗菌肽由于其在正常生理条件下具有抗微生物活性，且在天然免疫中具有广泛的功能，因此，可作为抗感染治疗试剂。抗菌肽在医药、畜牧、食品等领域显示了巨大的应用潜力。最近发现的环肽，相对于普通的线性肽有诸多的优点。研究表明环化可增加肽的生物学活性。内含肽介导的多肽环化技术为抗菌肽的环化研究提供了新思路。. 本研究中使用两种内含肽同时融合目标肽的策略，将两种不同的内含肽，Mxe GyrA和Ssp DnaB内含肽分别融合于目标肽的两端。由于两种内含肽使用不同的诱导条件，不同的pH和温度引发剪切的进行，最终在目标肽的N、C端形成一个天然的肽键。同时两种内含肽的两端都融合有几丁质结合域，可以使用柱上诱导环化的方法得到目标肽。研究选取N端和C基端较接近的plectasin、cyclosaplin、circulin A、heliomicin等4个抗菌肽和氨基端为目标肽，利用内含肽介导的环化技术对选定的抗菌肽进行环化研究，通过电喷雾ESI-MS质谱测定分子量的方法鉴定肽的环化情况。结果表明环化后的抗菌肽，circulin A对松鼠葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、大肠杆菌具有抗菌活性。Heliomicin抗菌肽表达效果不好，仍在摸索中，而其余2个抗菌肽无抗菌活性。cyclosaplin的抗肿瘤活性实验正在进行中。抗性失活的原因初步分析可能是由于该系统环化时，必须在氨基酸段引入一个Cys才可进行环肽生产，而选取的N、C端较近的天然抗菌肽中大多含有一个或多个Cys，新引入的Cys可能改变的肽中的二硫键的形成，从而改变多肽构象，使抗菌肽失去活性。结果与文献报道活性提高的结论还有一定差距，还需进步一研究阐明其原因。