金银花叶抑制致病菌的物质基础及其分子机理研究

目前人们常使用化学防腐剂减少致病菌，但它具有一定的毒副作用, 寻找天然抑菌物质受到世界各国的普遍重视。本项目拟选择具有较好抑菌效果且资源丰富的中药副产物金银花叶为对象，研究其抑菌物质基础、作用机理及高效分离方法。选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为研究菌株，金银花叶成分采用极性不同溶剂及色谱柱集成技术逐步分离直至单体化合物，同时配合体外抑菌实验跟踪分离过程，筛选抑菌成分。运用红外、紫外及核磁共振技术对抑菌单体化合物进行结构鉴定并获得抑菌成分的优选分离方法。利用食品保鲜实验验证抑菌物质的效果。采用荧光标记方法、试剂盒方法、透射电镜、电导仪等确定抑菌成分在细菌细胞的作用位点、酶含量与活性变化、细胞结构变化。通过本项目研究探明金银花叶抑菌的物质基础并阐明作用机理，对其他天然药物抑菌成分筛选及机理研究，提供可行的实验方法和理论依据。项目的开展和完成对于食品中病原菌使用植物成分进行安全控制具有深远的影响

化学防腐剂具有一定的毒副作用, 寻找天然抑菌物质受到世界各国的普遍重视，本项目选择金银花叶为对象，研究其抑菌物质基础、作用机理及高效分离方法。另外研究金银花叶的干燥方法；金银花叶HPLC指纹图谱及最佳采收期；金银花叶多酚氧化酶酶学特性；大孔吸附树脂纯化金银花叶总多酚工艺。结果如下：.　　　1、研究金银花叶抑菌活性成分提取工艺。.　　　（1）比较回流提取法、超声辅助提取法和索氏提取法对金银花叶抑菌成分提取效果，选择回流法提取抑菌成分；.　　　（2）通过爬坡试验确定金银花叶抑菌成分提取工艺，温度70℃、乙醇浓度60%、料液比1:20和时间2h。.　　　2、系统溶剂分层法及色谱方法分离筛选金银花叶的抑菌活性物质.　　　（1）用不同溶剂对金银花叶乙醇提取物进行萃取，得到石油醚萃取层、氯仿萃取层、乙酸乙酯萃取层、正丁醇萃取层和余液层5个萃取层（J1至J5）并比较他们的抑菌效果，结果各萃取层均有一定的抑菌效果，其中乙酸乙酯层（J3）效果最佳。.　　　（2）选择8种大孔吸附树脂对金银花叶多酚进行吸附、解吸试验，结果：NKA-Ⅱ、HPD500适用于对金银花叶萃取物分离。.　　　（3）用HPD500对J3进行分段，首先将J3分为两段（J3A和J3B），J3B的抑菌效果好于J3A。J3B继续分离，得J3B1和J3B2，J3B2抑菌效果更强。.　　　（4）抑菌活性部位J3A、J3B1和J3B2进一步分离，得到5种单体成分：3-O-咖啡酰奎尼酸、裂环氧化马钱素、木犀草苷、3,5-二-O-咖啡酰奎尼酸和4,5-二-O-咖啡酰奎尼酸。其中二-O-咖啡酰奎尼酸抑菌效果最好。.　　　3、研究抑菌物质绿原酸、异绿原酸A对大肠杆菌的抑菌机理，绿原酸类物质能在较短时间内破坏大肠杆菌细胞壁、膜的结构，增加细胞的通透性，异绿原酸A的作用程度强于绿原酸。.　　　4、金银花叶最佳的干燥方法为鼓风干燥处理。.　　　5、不同月份金银花叶指纹峰之间即有相关性，又有差异，最佳采收期为7月。.　　　6、以邻苯二酚为底物，金银花叶多酚氧化酶最适温度为45℃，pH值为6.5，柠檬酸是其酶促褐变安全、经济的抑制剂。.　　　7、对金银花叶抑菌物质提取工艺正交试验优化，最佳工艺：温度70℃、乙醇浓度60%、料液比1:15和时间1.5h。. 本项目研究对食品中病原菌使用植物成分进行安全控制具有深远的影响。