靶向Smad3及AP-1穿膜圈套核苷酸/聚乳酸－羟基乙酸微球的制备及在青光眼抗瘢痕治疗中的应用

滤过泡瘢痕形成是导致青光眼滤过手术失败的主要原因，抑制瘢痕形成是提高手术成功率的关键因素，目前尚无理想的青光眼抗瘢痕药物。研究表明伤口愈合过程中，炎性细胞分泌众多细胞因子，通过相应的受体介导，活化效应细胞胞内的Smad和AP-1信号通路。两条信号通路相互协调，共同调控与瘢痕形成相关基因的表达，在瘢痕形成中起关键作用。前期在自然基金小额资助下，设计出可同时拮抗Smad3和AP-1转录活性的圈套核苷酸，研究结果证实，其能强效抑制TGF-β所刺激的成纤维细胞的增殖及胶原合成。基于圈套核苷酸需借助转染试剂进入细胞内，且易被核酸酶降解及作用时间短的缺陷，本项目拟融入穿膜肽及纳米技术，合成以聚乳酸-羟基乙酸为载体，以穿膜肽引导的抗瘢痕圈套核苷酸纳米微球。后通过离体和在体实验研究其对青光眼滤过术后瘢痕形成的抑制效应。最终获得具有穿膜、抗核酸酶降解及缓释功能的抗瘢痕圈套核苷酸纳米微球。

滤过泡瘢痕形成是导致青光眼滤过手术失败的主要原因，抑制瘢痕形成是提高手术成功率的关键因素，目前尚无理想的青光眼抗瘢痕药物。研究表明伤口愈合过程中， Smad和AP-1信号通路共同调控与瘢痕形成相关基因的表达，在瘢痕形成中起关键作用。我们设计并合成了多条靶向Smad3及AP-1的双链圈套寡核苷酸，即在分子中同时拥有Smad3及AP-1的结合序列。通过多项试验筛选，我们最终筛选出一条双链线状圈套核苷酸AFODN4：Sense 5'-GAGCCAGACATGAGTCATGTCTGCATTACCTCAC-3'， anti-sense 5'-GTGAGGTAATGCAGACATGACTCATGTCTGGCTC-3'; 体外实验证实AFODN4的抑制由Smad3及AP-1介导的纤维化作用。小鼠动物致伤模型结果显示AFODN4处理组伤口肉芽组织胶原染色明显弱于随机圈套对照组，也低于AP-1和Smad3组，AFODN4处理组显示伤口肉芽组织中激活的成纤维细胞或肌成纤维细胞的数量明显低于随机圈套对照组。Western blot检测显示AFODN4圈套治疗组不仅明显减少伤口肉芽组织中纤维化相关介导因子TGF-b1, CTGF, and PAI-1的表达，而且还明显减轻炎症介导因子IL-6，TNF-a及IL-1b的表达。EMSA实验显示AFODN4圈套治疗组，伤口肉芽组织中AP-1及Smad3的结合活性都很低，由此说明我们设计的AFODN4圈套在体内具有明显的抑制AP-1及Smad3结合活性的作用。进一步制备AFODN4/PLGA纳米微球，通过电镜观察，AFODN4与PLGA可通过乳化法形成粒径均一的球形纳米粒，但存在较明显的交联现象，并且在放置过程中容易出现团聚。通过激光粒度仪对纳米粒的粒径及表面电位进行测定，该纳米粒粒径为162±4.1 nm，zeta电位为-13.24±0.43 mV。AFODN4/PLGA纳米粒虽呈现大小均一的球形，但有较多的交联。而纳米微球的载药量、包封率及体外释药性能鉴定显示，AFODN4/PLGA纳米微球有明确的缓释功能，但其载药量及包封率都不理想，需要进一步的提高。