氰戊菊酯引起精子DNA损伤后的受精卵内修复及其分子机制研究

氰戊菊酯(fenvalerate, Fen)是一类广泛使用的拟除虫菊酯类农药。国内外研究发现，在职业或非职业接触人群中，Fen均显著增加精子DNA损伤。携带这种损伤的父系DNA是否会将损伤传递给子代？受精卵如何修复该损伤？目前的研究却鲜有涉及。.本项目拟用人精子的穿卵试验评估大样本人群的受精力，综合分析人群的Fen内暴露水平-DNA损伤-穿卵率三者的关联，明确Fen所致精子DNA损伤后，对受精能力的影响并探讨阈值；并以Fen造模损伤精子的体外精卵结合实验为基础，通过比较受精卵不同时期的①存活率、卵裂率等②受精卵各期有无发育延迟③受精卵内ROS水平及TUNEL损伤情况，从而评价父系DNA损伤后受精卵内的修复事件；再结合各期的受精卵的蛋白质组学研究，初步阐明受精卵动态修复Fen所致父系DNA损伤的分子机制、修复时期及关键的靶蛋白。本研究可为阐明氰戊菊酯所致男性生殖危害及其遗传效应提供重要参考。

本项目基于环境、基因及其交互作用的研究思路，结合人群、小鼠、细胞各个层面的研究数据，系统探讨了氰戊菊酯农药对男性生殖细胞的遗传毒性作用及可能的修复机制。（1）人群研究的重要发现：检测并分析不育及对照人群的尿氰戊菊酯内暴露（3-PBA）水平、精子DNA损伤水平、精子DNA的8-OHdG损伤标志水平、精液中超氧化物歧化酶活性、精液质量（精液参数及精子DNA完整性）等指标，及人群中端粒酶相关基因、SOD基因等遗传易感标记，并详细探究其相关性，从基因、环境及交互作用角度研究男性不育的病因。（2）小鼠精母细胞（GC-2 cell line）体外研究显示：通过化合物染毒造模精母细胞损伤，polychlorinated biphenyl (PCBs)会引起雄性生殖细胞损伤，且与雌激素受体相关。在不同浓度Aroclor 1254染毒情况下，且呈现剂量反应相关性。此外，染毒后精母细胞的ER-α受体表达减少，ER-β受体表达增加。PCBs染毒引起的细胞增殖减少，被拮抗剂或激动剂所改变，且casepase-3，bcl-2，和cyclinD1的表达也相应改变，相关结果已发表。（3）课题实施中新发现的XRCC1，为明确精子DNA损伤修复的机制，成功建立了XRCC1-CRE条件性敲除小鼠，并研究其在化学物所致的父源性遗传损伤的修复机制。睾丸组织的XRCC1定位，显示在各级生精细胞均有表达，在精母细胞尤其高表达。在胚胎9.5至出生后3天这段时间，XRCC1蛋白直接参与了精子发生的过程。XRCC1特异敲除基因小鼠构建成功，雄性小鼠出现不育的表型：睾丸显著减小，产仔数减少，精子数目和活力明显减少，病理切片HE染色，显示睾丸生精细胞出现不同程度损伤，附睾内精子数目明显减少。进一步的研究发现，生精细胞的凋亡集中在精原细胞及精母细胞更甚，γH2AX活化，提示出现睾丸内损伤细胞的堆积。深度测序结果提示，敲除组与野生型组别在17号染色体和线粒体染色体表达显著不同。XRCC1的缺失导致线粒体基因组的不完整，而非核基因组和端粒酶活性。深度测序及线粒体基因半定量，mRNA表达，酶活性测定，ATP assay等结果提示，线粒体异常，机制还有待进一步的研究。