新型微柱细胞膜色谱及其在抗体类药物质量控制中的应用

Based on previous work on micro-column cell membrane chromatography (mCMC), this project will focus on the research of the immobilization mechanism of cell membrane and the use of mCMC for the quality control of antibody drugs. Porous silica layer-coated capillary of different pore sizes and surface properties will be initially fabricated. The effect of pore sizes and surface properties on the immobilization of cell membrane will be systematically characterized to further improve the previous mCMC method. Thereafter, the application of mCMC on the analysis of monoclonal antibody drugs (mAbs) and antibody-drug conjugates (ADC) will be investigated. Trasduzumab and its ADC T-DM1 will be selected as models. Human epidermal growth factor receptor 2 highly-expressing cells will be used for the establishment of mCMC. The prepared mCMC method will be systematically investigated on the determination of content, aggregates, peptide mapping and binding activity of both trasduzumab and T-DM1. This project will reveal the effects of the properties of stationary phases (including pore size and pore surface property) on the immobilization of the cell membrane and the chromatographic properties of mCMC, and finally establish novel and high-efficient mCMC method. Besides, application of mCMC for the analysis of mAbs and ADC will be also included. The project will provide new ideas and methods for the quality control of biological macromolecular drugs.

本项目拟在前期对微柱细胞膜色谱（mCMC）的研究基础上，对细胞膜的固定化机理以及mCMC在抗体类药物质量控制中的应用进行研究。首先构建孔径可调、且具有不同“亲疏水”性质的多孔硅胶涂层毛细管微柱，研究孔径、表面性质等因素对细胞膜固定化的影响，完善mCMC方法。随后，考察mCMC法在单克隆抗体类药物（mAbs）和抗体-药物偶联物（ADC）分析中的应用，建立与抗体药物蛋白活力相对应的质量控制方法。以曲妥珠单抗及其ADC T-DM1为模型，建立人表皮生长因子受体2过表达细胞mCMC，研究该方法在含量测定、多聚体检查、肽谱检查、结合活性测定方面的应用。本项目将确定固定相基质的孔径、孔表面性质对细胞膜固定化及mCMC色谱行为的影响，在此基础上建立新型高效mCMC法；研究mCMC法在mAbs和ADC药物分析中的应用，为生物大分子药物的质量控制提供新的思路和方法。

细胞膜色谱（CMC）技术是进行药物活性成分筛选和鉴定，以及研究分子间相互作用的高效方法。但是传统CMC往往需要消耗较多的细胞，如107-108，这极大的限制了该方法在稀缺的、难以大量获得的细胞研究中的应用。针对这一问题，本项目提出了采用石英毛细管为细胞膜载体的微柱细胞膜色谱（mCMC）技术，对细胞膜的固定化机理进行了深入研究，并将mCMC方法应用于抗体类药物的质量控制。首先成功制备了多孔硅胶聚合物涂层的毛细管微柱，通过调整反应物配比，实现了多孔硅胶毛细管柱的孔径、孔隙率、涂层厚度以及孔表面性质的有效调控。通过考察不同表面性质微柱对细胞膜固定化的影响规律，发现了载体表面的孔结构对细胞膜的固定化数量及固定化后细胞膜的活性和稳定性有重要影响。通过激光共聚焦显微镜观测荧光染料修饰细胞膜的固定化行为，结合CMC和mCMC实验结果，推断细胞膜在多孔硅胶表面的固定化机理为：“插入-融合”，即：细胞膜先插入载体的孔内，暴漏在介质表面的细胞膜再彼此融合，最后使整个硅球全部被细胞膜包裹，实现细胞膜的固定化。随后，采用Her2阳性的乳腺癌细胞系SKBR3与CD20阳性的白血病细胞系BALL1，分别制备了对应mCMC微柱，并对相应单克隆抗体药物Trastuzumab与Riduximab进行了色谱分析。通过本项目的研究，探明了载体的孔径、表面性质、操作压力等因素对细胞膜固定化的影响规律，建立了新型高效的 mCMC 法；并采用 mCMC 法研究抗体类药物的质量控制方法，相关工作为抗体类药物的质量控制提供了新的思路和方法。本项目的实施，培养了3名硕士研究生，3名在读研究生正在继续相关研究工作。本项目的相关工作在《J. Chromatogr. A》、《Biomaterials Sci.》、《Anal. Bioanal. Chem.》等国际著名杂志上发表SCI收录文章7篇，申请中国发明专利1项。