内镜黏膜下剥离术后食管狭窄：关键miRNA促进肌成纤维细胞表型转化在食管粘膜损伤及修复中的作用

Esophageal stricture, which is one of the most common complications after endoscopic submucosal dissection (ESD), is most likely due to the contracture of scar tissues. The differentiation of fibroblasts to contractile myofibroblasts, which is often induced by TGF-β1, is crucial for wound healing and a hallmark of tissue scarring and fibrosis. However, how myofibroblast works during wound repair after ESD remains elusive. We have successfully constructed an esophageal ESD model in pigs and preliminary study revealed that serum TGF-β1 levels were significantly increased after esophageal ESD. Given that several miRNAs serve as the import regulators of fibroblast and other cellular processes related to TGF-βsignaling, we aim to: ① clarify the dynamic process of wound repair after esophageal ESD; ② screen and verify the distinctive miRNAs between the primary cultured fibroblast and the TGF-β1 induced myofibroblast; ③ retroregulate the expression of target miRNAs and further investigate the target genes and signaling pathways by using expression profile microarrays and enzyme fluorescent element report gene method; ④determine the effects of endoscopic steroid injection on myofibroblast trans-differentiation and target miRNA expression, as well as to evaluate the efficacy of steroid for the prevention of stricture formation after ESD.

严重疤痕挛缩导致的食管狭窄是内镜黏膜下剥离（ESD）术后常见并发症。TGF-β1诱导成纤维细胞表型转化而来的肌成纤维细胞是引起瘢痕挛缩的关键效应细胞，但其与ESD术后创面修复的关系尚不清楚。我们前期成功构建了猪管粘膜ESD切除模型，并发现ESD术后患者血清TGF-β1表达明显升高。鉴于多个miRNA与成纤维细胞功能调节及TGF-β相关的其他多种细胞学过程的密切联系，我们拟在动物模型和临床患者中：①阐明食管ESD术后创面修复的动态过程；②TGF-β1诱导原代成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，通过miRNA表达谱芯片，筛选出这一过程中差异表达的miRNA谱；③反向调控候选miRNA 表达，运用蛋白质芯片及荧光素酶报告基因法等，探寻miRNA调控的关键基因和信号通路；④采用局部激素治疗，观察对肌成纤维细胞的表型转化和关键miRNA表达的影响，评价对食管狭窄的预防和治疗价值。

内镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection, ESD）是治疗食管早癌的一种新兴的微创术式，具有创伤小、疗效确切等优点，但对于较大食管病变ESD常会导致术后出现食管狭窄，影响病人的生活质量。基于以往的研究，普遍认为创面修复挛缩过程是导致食管狭窄的机制，而成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化（FMT）是这一过程的重要调控事件。其中，转化生长因子-β1（TGF-β1）又是FMT的重要诱导因子。既往对其他组织的成纤维细胞研究表明，miRNA与成纤维细胞的功能关系存在密切联系，但缺乏关于FMT的报道，且尚无食管成纤维细胞的相关研究。基于此，我们对食管FMT中关键调控的miRNA进行研究，并探索了激素对FMT的影响和在预防食管狭窄中的作用。通过利用组织块法和酶消化法，我们成功从外科手术患者的食管标本中分离了稳定生长传代的食管成纤维细胞，通过免疫荧光进行了验证；通过加入TGF-β1成功诱导了具有特征marker的肌成纤维细胞系，并观察了其表型（收缩性和胶原分泌）的改变；通过miRNA芯片筛选出了成纤维细胞和TGF-β1诱导的肌成纤维细胞的差异miRNA表达谱，并对其中p<0.01, |Fold Change|＞2的miRNA进行了qPCR的验证，筛选出了5个差异表达的miRNA。通过在猪ESD模型中创面局部注射的方式，评价了激素对食管狭窄的预防和治疗价值，并在临床病例中加以验证；通过在TGF-β1诱导的食管肌成纤维细胞进行激素干预，成功发现其抑制FMT的作用。本研究在国内率先建立动物ESD狭窄模型和分离纯化食管成纤维细胞体系，对食管成纤维细胞的FMT表型转化首次进行验证，为日后进一步研究相关食管FMT的其他机制研究奠定了基础；筛选出差异表达的miRNA；率先在国内应用局部注射激素预防食管ESD后狭窄，取得了可喜的治疗效果，并在细胞实验中予以验证。miRNA下游的调控机制及在动物模型中的效果和其他相关调控FMT的机制还有待进一步研究。