MRP8/14-TLR4相互作用诱导生成的IL-1beta与内侧颞叶癫痫慢性期形成的关系及机制研究

本项目利用内侧颞叶癫痫(MTLE)大鼠模型、MTLE患者手术切除的海马组织、体外培养小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元，结合侧脑室注射、shRNA基因沉默技术、质粒转染、免疫沉淀以及激光显微共聚焦等研究策略，探讨MTLE慢性期形成的机制。本研究首次提出MTLE时海马组织内小胶质细胞产生的MRP8/14与星形胶质细胞上的TLR4相互作用后，诱导IL-1 beta持续高水平表达可能是导致MTLE慢性化进程的启动因素之一，并通过激活神经元内PI3K/Akt/mTOR信号通路调控海马神经元苔藓纤维出芽及突触重建，促进MTLE的慢性化过程。对此问题的深入研究，将有助于从一个全新角度研究MTLE的发病机制，为MTLE防治提供新的思路。

内侧颞叶癫痫( MTLE)是最常见的癫痫综合征之一，神经元丢失、轴突出芽和突触重组是导致MTLE慢性发作及难治的病理基础。已有研究提示海马内的IL-1β持续的高表达可能与MTLE由潜伏期进入慢性发作期相关。是何种信号导致海马内IL-1β生成增加，以及IL-1β在潜伏期如何作用于神经元最终导致机体进入慢性发作期？目前尚不清楚，也未见相关报道。.本研究通过建立MTLE大鼠模型和原代培养海马神经元细胞癫痫模型，收集MTLE患者手术切除海马组织，采用shRNA基因沉默技术、Real time-PCR、免疫印迹、免疫荧光结合激光扫描共聚焦等技术，从在体到细胞至分子水平进行研究。研究内容分为3部分：⑴ 证实MTLE模型大鼠和患者海马组织中MRP8生成增多，而小胶质细胞是MRP8的主要来源；⑵ MTLE时海马组织中产生的MRP8与星形胶质细胞上的TLR4结合，诱导NF-κB活化后生成大量IL-1β；⑶IL-1β与海马神经元上受体结合后，经PI3K/Akt/mTOR信号通路调控苔藓纤维出芽，突触重建。.研究中发现：⑴ MRP8处理星形胶质细胞，TLR4、NF-κB和IL-1β表达均明显增加；利用shRNA-TLR4转染抑制TLR4表达，MRP8不能促进星形胶质细胞内NF-κB和IL-1β表达增加；⑵ WB或co-IP法发现MTLE模型鼠和患者海马内PI3K-p85、P-Akt及p70S6K表达明显增加，体外神经元培养证实IL-1β刺激可使Akt、p70S6K的磷酸化，并存在时效与量效关系；⑶ Rapamycin可抑制MTLE鼠癫痫样放电、苔藓纤维出芽和S6k磷酸化，膜片钳技术证实Rapamycin预处理可抑制无Mg或无Mg+IL-1β组诱导的神经元放电；⑷ 慢病毒转染抑制PI3K-p85表达或Rapamycin抑制mTOR后，WB及co-IP显示IL-1β所致PI3K-p85、P-Akt、p70S6K和MAP2的表达均明显受抑制；⑸ IL-1β及无Mg刺激后神经元突触囊泡数明显增加，慢病毒转染PI3K-p85 SiRNA或Rapamycin预处理都能减少IL-1β所致的神经元的突触部位突触囊泡的增加。.本研究结果不仅能从病因的角度为MTLE治疗提供新的靶点，还有可能寻找到MTLE慢性化过程中的生物学标志物，从而为预防MTLE的慢性化过程提供新的思路。