光动力治疗对中性粒细胞胞外陷阱(NETs)捕杀金黄色葡萄球菌的作用及机制研究

The abuse of antibiotics has led to a lot of trouble to treat skin infection in clinical practice, Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is an effective alternative or combined treatment strategy. Neutrophil extracellular traps (NETs) show superior effect on microbes, singlet oxygen is essential for NETs formation. In our previous studies, we found that Rose begal photodynamic therapy showed excellent antimicrobial effect, Rose bengal Acetate-mediated PDT (RBAc-PDT) could form singlet oxygen. We speculate that RBAc-PDT could treat cutaneous Staphylococcus aureus infection, the production of 1O2 may contribute to NETs formation and enhance its antimicrobial activity. So far there is no such reports on the role and mechanism of photodynamic therapy induces the formation of neutrophil extracellular traps to increase Staphylococcus aureus clearance. So we aim to study the mechanism of aPDT on intrinsic immunity, and explore more photosensitizers to treat different microbes through NETs formation, and we hope to provide new strategy for skin infection therapy.

抗生素的广泛和不合理应用给临床治疗皮肤感染加大了难度，光动力抗菌治疗(Antimicrobial photodynamic therapy, aPDT）是一种有效的替代或联合治疗策略。而中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps，NETs)具有优越的抗菌功能，其形成依赖于活性氧。申请人前期研究发现玫瑰红光动力治疗具有良好的抗菌作用，玫瑰红醋酸盐介导的PDT(RBAc-PDT)产生单态氧。我们推测，RBAc-PDT可以治疗皮肤金黄色葡萄球菌感染，产生的单态氧可能促进NETs的形成且增强其抗菌活性。国内外尚无相关报道光动力治疗对NETs捕杀金黄色葡萄球菌的作用及机制的研究。我们希望以此为切入点，更深入地了解aPDT增强天然免疫的作用和机制，并为下一步扩展不同光敏剂通过NETs捕杀不同微生物奠定实验基础，为皮肤感染治疗的新策略提供理论依据。

背景：光动力抗菌治疗(Antimicrobial photodynamic therapy, aPDT）是一种有效的替代或联合抗生素治疗策略。玫瑰红醋酸盐(Rose bengal diacetate, RBDA)是乙酰化的玫瑰红前体。本课题探索RBDA-aPDT对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 的杀菌作用及其机制，同时建立糖尿病小鼠MRSA皮肤感染模型，探讨光动力的治疗效果及对中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular trap, NETs) 形成的影响及机制。.方法：（1）体外实验：以MRSA USA300、大肠杆菌ATCC25922、白色念珠菌SC5314作为研究对象。实验分为RBDA-aPDT组和RBDA/KI-aPDT组，对照组为RBDA组、RBDA+KI组、空白对照组。计算PDT后各组微生物的菌落形成单位。（2）杀菌机制实验：以MRSA USA300作为实验对象，分为RBDA-aPDT组和RBDA/KI-aPDT组，并设置RBDA组和空白对照组，用单线态氧荧光探针和O11活性氧荧探针检测aPDT后MRSA中ROS变化；提取MRSA总蛋白和基因组，用凝胶电泳检测aPDT后蛋白质和DNA含量；用透射电镜和扫描电镜观察MRSA形态学改变。（3）体内实验：建立皮肤伤口MRSA感染的糖尿病小鼠模型，分组同前。通过拍照、H&E染色以及免疫荧光实验检测治疗后伤口愈合情况。.结果：1 µm的RBDA-aPDT对MRSA的杀灭率是68.32%，0.5 µm RBDA与KI联合用药对MRSA的杀灭率是99.50%。RBDA-aPDT和RBDA/KI-aPDT激发MRSA产生活性氧及单线态氧，使DNA和蛋白质含量降低，并破坏细胞及细胞壁结构。aPDT使小鼠伤口愈合速度更快，愈合后期IL-6、IL-1β含量降低，Ki67含量增加。.结论： RBDA-aPDT能够使MRSA蛋白质降解，DNA损伤以及细胞壁结构破坏。KI可以促进RBDA-aPDT的杀伤效应。在MRSA皮肤伤口感染的糖尿病小鼠中，RBDA-aPDT和RBDA/KI-aPDT能够促进伤口愈合。RBDA-aPDTk可能增加小鼠创面受金黄色葡萄球菌感染后NETs的产生。