鞘糖脂生物合成通路及关键基因对猪F18大肠杆菌抗性的调控机理研究

本研究在综合前期苏太猪F18大肠杆菌敏感型和抗性型全同胞配对个体表达谱芯片和蛋白质组学分析结果的基础上，锁定鞘糖脂生物合成-球系列（Glycosphingolipid biosynthesis-globo series）通路及其中确定的7个功能基因，以F18菌毛钓取受体蛋白技术筛选F18菌毛受体蛋白，进一步确定本项目最终研究的关键基因，利用RNAi和过表达试验、Co-IP免疫共沉淀、仔猪小肠上皮细胞对F18菌毛黏附的定性和定量检测等技术，从DNA、mRNA、蛋白质3个水平，分析关键基因对仔猪肠上皮细胞黏附F18菌毛的影响，研究通路及其中的关键基因在仔猪抗F18大肠杆菌过程中的功能和调控网络，探讨猪F18大肠杆菌病抗性的分子机理，并进一步确定抗性主效基因及相应的分子遗传标记，以期突破中国地方猪种抗F18大肠杆菌病理论研究和育种实践中的瓶颈，为中国地方猪种抗F18大肠杆菌病育种提供依据和指导。

F18大肠杆菌是目前养猪业中最普遍、危害最大的肠毒素大肠杆菌病原之一，迄今为止国内地方猪种未发现有应用价值的F18大肠杆菌病抗性遗传标记。本研究根据前期大肠杆菌病抗性型和敏感型资源群体表达谱芯片和蛋白质组学综合分析的基础上，锁定了鞘糖脂生物合成—球系列通路及7个功能基因，通过组织差异表达、基因表达相关性、细胞水平验证等分析，结果显示，FUT2基因在抗性个体十二指肠和空肠组织中的表达量极显著低于敏感性个体的表达量（p<0.01），在肠道组织中的表达量与FUT1、ST3GAL1、B3GALNT1等其他通路基因达到了极显著正相关（p<0.01），并且LPS诱导小肠上皮细胞后大部分通路基因表达水平均发生显著的变化，初步确定FUT2基因为仔猪上皮细胞F18大肠杆菌受体形成的关键基因，对断奶仔猪F18大肠杆菌病抗性起到关键的调控作用。本研究进一步成功建立了大肠杆菌黏附水平的qPCR定量检测方法，并利用RNAi、仔猪肠上皮细胞对F18菌毛黏附的定量检测等技术体系在细胞水平上对FUT2基因进行功能验证，结果表明，FUT2基因沉默后鞘糖脂通路中FUT1、B3GALNT1和NAGA基因表达水平发现显著下调（p<0.05），并且FUT2基因沉默后的细胞对于大肠杆菌F18ab的黏附水平表现为极显著上升（p<0.01）。在中国地方猪品种梅山猪群体中，利用PCR克隆和遗传效应分析来进一步寻找关键基因FUT2的潜在遗传标记，结果表明，FUT2基因-84 bp(C→T)位点对基因的表达水平具有显著地调控影响，梅山猪TT基因型为E. coli F18抗性基因型，同时具有较高的产仔性能，而且不对机体一般抗病力产生不利影响。因此，有必要把FUT2基因-84 bp(C→T)位点作为梅山仔猪抗E. coli F18的分子遗传标记做进一步系统研究。本研究揭示了鞘糖脂生物合成—球系列通路基因间的网络调控关系，并进一步筛选确定了猪F18大肠杆菌病抗性主效基因及相应的分子遗传标记，有望突破中国地方猪种抗F18大肠杆菌病理论研究和育种实践中的瓶颈，为中国地方猪种抗F18大肠杆菌病育种提供科学依据和技术支撑。