SUMO1修饰NADPH氧化酶调控颗粒细胞内ROS生成的实验研究

Reducing the level of reactive oxygen species (ROS) in granulosa cells during controlled ovary hyperstimulation process improves oocytes quality and IVF-ET clinical pregnancy rate. SUMO modification regulates ROS production, but the function of SUMO under granulosa cell suffering oxidative stress is unclear. We found increased level of ROS enhanced SUMO -bindings and strong expression of SUMO1 validly inhibited granulosa cells apoptosis. Therefore, we proposed SUMO1 inhibited ROS generation and protected granulosa cells. In order to verify this hypothesis, we constructed adenovirus vectors (Ad-SUMO1 and control Ad-GFP) , built induced Ubc9 knockout mouse model within granulosa cells and intend to study the influence of ROS generation under SUMO1 overexpression and no expression. Further more, we found SUMO1 regulates ROS generation though NADPH oxidase pathway. We will further use co-immunoprecipitation, fluorescence location, building SUMO1 mutants and other molecular biology methods to explore and verify NADPH subunits （Rac1 or p47phox）binding with SUMO1 and their binding sequences. We hope to reveal pathways and targets of inhibited ROS via SUMO1, and provide new ideas for clinical antioxidant therapy.

降低促排卵过程中颗粒细胞内活性氧自由基(ROS)水平将改善卵子质量，提高IVF-ET妊娠率。SUMO化修饰对ROS的产生具有调控作用，但在颗粒细胞氧化应激状态下的功能尚不明了。我们发现ROS水平升高将激发SUMO化结合增强，SUMO1的强表达有效抑制了颗粒细胞凋亡，因而提出SUMO1抑制ROS生成，对颗粒细胞产生保护效应的假设。为此我们构建了Ad-SUMO1腺病毒载体并建立了颗粒细胞内诱导性Ubc9基因敲除小鼠模型，拟从体内和体外两方面研究SUMO1过表达和去表达对颗粒细胞内ROS生成的影响。同时，在机制研究中我们发现NADPH氧化酶可能是SUMO1修饰的底物蛋白。我们将通过免疫共沉淀、荧光定位和构建SUMO1突变体等分子生物学手段探寻和反证SUMO1与NADPH氧化酶结合的亚基（Rac1或p47phox等）和序列，希望揭示SUMO1抑制ROS的途径和靶点，为临床抗氧化治疗提供新思路。

改善体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗过程中的卵子质量是提高妊娠率的关键。卵母细胞在促排卵过程中可能受活性氧自由基（ROS）损伤，导致质量下降。降低卵母细胞周围颗粒细胞层的ROS水平对改善卵子质量有重要意义。本项目通过临床标本检测和体外实验证实了颗粒细胞内高ROS水平导致细胞凋亡，降低卵母细胞活性，降低患者临床妊娠率。在体外实验中发现高ROS水平激发了SUMO1的增强表达，SUMO1的强表达有效抑制了颗粒细胞凋亡，验证了我们之前提出的假设：SUMO化修饰对颗粒细胞起保护作用。在进一步的机制探索阶段，我们发现ROS来源之一的NADPH氧化酶的多个亚基在颗粒细胞内有表达，在高ROS状态表达增强；NADPH氧化酶特异性的抑制剂能够有效降低ROS水平。因此，SUMO1可能是通过修饰NADPH氧化酶来发挥对ROS的调控的。我们进而通过免疫共沉淀方法检测到SUMO1与NADPH氧化酶的结合亚基Rac1,又构建了Rac1的突变体，反证Rac1是结合靶基。这对于后续的临床转化研究有重要意义，提供了进行临床治疗的理论依据及作用靶点。