基于BBB及Fas/FasL通路的“开关”药对“引经入脑”多功能脂质体机制评价

The aim of this study is to resolve the problem of poor curative effect, short lifetime, and high mortality in the treatment of glioma from the promotion reversible opening of blood brain barrier (BBB), the active targeting of tumor cells and the inhibition of multidrug resistance (MDR). Firstly, the reversible opening of BBB would be regulated by the active fraction of “guiding medicine into brain” traditional Chinese medicine, and the distribution probability of drugs in brain tissue is increased accordingly; Secondly, The effect of active targeting to glioma cells will be achieved via the specific combination of the active targeting anti-multidrug resistance liposomes and the tuomor cells; Thirdly, the sensitivity of anti-tumor drugs is improved in virtue of the inhibiting MDR ability of tetrandrine. Finally, the synergic targeting effects are achieved by using the above methods. The study will discuss the related mechanisms from the reversible opening of BBB and the Fas/FasL apoptosis signaling pathways after combined administration. It is based on the theory of traditional Chinese medicine, and combines with modern technology of targeting drug delivery. It will further improve the incorporation between theory of traditional Chinese medicine and modern preparation technology, provide a new treatment model for glioma, and offer theoretical and experimental bases for the expending clinical application of traditional Chinese medicine.

本课题从可逆性调节血脑屏障（BBB）通透性、增强对脑胶质瘤细胞的主动靶向及抑制多药耐药三个角度出发，解决脑胶质瘤患者的治疗疗效差、生存期短、死亡率高等问题。项目首先利用具有“引经入脑”中药的有效部位促进机体BBB生理性可逆开放，提高脂质体在脑组织中分布机率；然后利用主动靶向抗耐药脂质体对脑胶质瘤细胞的特异性靶向结合，实现对肿瘤细胞的主动靶向；最后利用粉防己碱的抗多药耐药性质，提高脑胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而达到协同靶向的治疗目的。课题拟从“引经入脑”中药有效部位的可逆性调节BBB通透性及联合给药后脑胶质瘤细胞凋亡的Fas/FasL信号传导通路两方面探讨课题的相关作用机制。本课题以中医药理论为基础，结合现代主动靶向给药技术，可进一步完善中医药理论与现代制剂技术的有机结合，为脑部疾病提供新的治疗模式，为拓展中医药在临床抗肿瘤方面的应用提供新的理论依据。

首先选取临界CO2萃取法，以挥发油的收率为指标，采用星点设计-效应面法优选了石菖蒲和苏合香药材提取时不同指标对提取效率的影响。构建了RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体，分别从不同角度考察了脂质体的理化性质。以BBB模型的通透性为指标优选了石菖蒲和苏合香饮片有效部位调节BBB的最佳作用时间和浓度，并考察了有效部位调节BBB的作用机制。课题从不同方面全面考察了RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体的体外作用机制。采用Western Blot法测定了C6、C6/ADR细胞中死亡受体的表达，利用酶联免疫试剂盒法检测了C6、C6/ADR细胞中凋亡基因的表达，采用流式细胞仪检测了C6、C6/ADR细胞中线粒体膜电位的改变，荧光显微镜法测定了C6、C6/ADR细胞中凋亡酶的活性。以SD大鼠为实验动物模型，考察了灌胃有效部位前后不同脂质体的代谢动力学和组织分布。考察了灌胃有效部位前后不同脂质体在荷瘤小鼠中的药效学。结果优选出了超临界CO2萃取法的最佳工艺，RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体的粒径大小均匀、包封率较高、物理稳定性良好。有效部位对BBB调节最佳的作用时间为0.5 h、浓度为0.10 g药材/ml，给药后可以降低细胞的膜电位、减少细胞内钙离子浓度并降低细胞膜中P-gp蛋白的表达。RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体显著抑制C6/ADR细胞中ABC转运蛋白的表达，对C6、C6/ADR细胞的增殖具有明显的抑制作用，孵育过量的RGD肽后可以减低脂质体的上述作用。RGD修饰异长春花碱与粉防己碱脂质体通过促进C6、C6/ADR细胞中Fas、FasL蛋白的表达、降低C6、C6/ADR细胞线粒体膜电位、增加细胞中促凋亡基因表达、降低细胞中抗凋亡基因表达、增加细胞中凋亡蛋白表达，从而起到促进细胞凋亡的作用。“引经入脑”中药有效部位可以明显地提高荧光信号在脑组织中分布，可以明显提高普通脂质体跨越血脑屏障的能力。药效学研究表明灌胃给予“引经入脑”中药有效部位后可以在一定程度上提高荷瘤小鼠的生存时间，并且可以明显的诱导肿瘤部位的肿瘤细胞凋亡。