从软骨细胞自噬及JAK/STAT通路探讨基于“经筋理论”针刀对兔KOA模型关节软骨的保护机制

The understanding based on the muscle meridian theory of the KOA,guiding choosing points of acupotomy insertion,which has significant curative effects.At present, domestic and foreign research shows that chondrocyte apoptosis，autophagy and cytokines are the main factors of KOA disease process,the JAK/STAT pathway in regulating gene expression, inhibit cell apoptosis to protect cartilage cells; cartilage cells decreased the level of autophagy leads to cartilage cell death.We believe that the mechanism of the treatment of KOA based on the reinforcement theory of needle knife may be related to the JAK/STAT pathway and autophagy. The project intends to adopt KOA rabbit model, meridian theory point of intervention, by observing the changes of cartilage cells and TUNEL to detect the apoptosis rate of JAK/STAT signal detection system, fluorescence quantitative PCR and immunoblotting technique in cartilage of Bcl-2, Bcl-xL, Caspase-3, Beclin-1 and protein expression of LC3-II/I, autophagy electron microscope, MTT method was used to detect autophagy influence on cell activity, flow cytometry to detect autophagy on cell number, to acetylation activity detection of SIRT1 activity, immunohistochemistry SIRT1 protein, clarify the Acupotomy mechanism of KOA, to provide new ideas and theoretical basis for the prevention and treatment of KOA.

基于经筋理论对KOA的认识，指导针刀选点，临床疗效显著。目前国内外研究表明细胞因子的参与、软骨细胞凋亡及自噬是KOA病变过程的最主要因素，其中JAK/STAT通路调节相关基因表达，抑制细胞的凋亡来保护软骨细胞；软骨细胞自噬水平下降导致软骨细胞死亡。我们认为基于经筋理论针刀治疗KOA的作用机制可能与细胞自噬及JAK/STAT通路有关。本项目拟采用兔KOA模型，经筋理论指导选点干预，通过观察软骨细胞的改变、TUNEL法检测凋亡率、荧光定量PCR及软骨免疫印记技术检测JAK/STAT信号系统中的Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-3、Beclin-1蛋白表达及LC3-II/I值，自噬的电镜观察、MTT法检测自噬对细胞活性影响、流式细胞术检测自噬对细胞数量影响、去乙酞化活性检测SIRT1的活性、免疫组化观察SIRT1蛋白，阐明针刀对KOA作用机制，为KOA的防治提供新思路和理论依据。

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）导致关节疼痛和下肢功能障碍严重影响患者，给社会造成巨大经济负担。目前KOA治疗在软骨保护来延缓或逆转病程方面缺乏有效干预措施。而针刀具有“针刺”和“刀割”双重功效，基于经筋理论指导针刀治疗KOA疗效确切，被《中医骨伤科临床诊疗指南·膝痹病(膝骨关节炎)》、《膝骨关节炎中医诊疗指南(2020年版)》等诊疗指南所推荐。然而，其具体分子机制尚不明确，阻碍其推广运用。.本项目首先通过文献研究阐明针刀治疗KOA的安全性和有效性。然后凭借肌骨超声较好软组织分辨力、动态对比成像、无辐射等优势，评价KOA患者常见筋结病灶点“鹤顶次”“髌内下”“髌外下”“阴陵次”解剖特征，并从形态、血流灌注、组织硬度等方面探讨KOA兔股直肌病灶点特点。并对制备KOA兔模型的Videman 法进行改良和评价，采用X线、MRI活体成像、原代软骨细胞提取、行为学检测、HE染色、Tunel染色、免疫荧光、电镜、Western blot、Q-PCR等技术，从动物整体、组织、细胞和分子等不同层面，以软骨细胞自噬和凋亡为切入点，部分阐明针刀治疗KOA的软骨保护机制。.我们研究发现：（1）针刀治疗KOA疗效确切，较非甾体药物具有优势；（2）肌骨超声可为KOA筋结病灶点病变特征、性质的判断提供影像学证据，能实时可视化引导针刀治疗；（3）基于经筋理论针刀“解结法”干预可以有效改善KOA兔行为学、软骨病理形态，其分子机制与调整膝关节力学结构，改善软骨微环境，调控Beclin-1/Bcl-2/Caspase3介导的自噬和凋亡通路，增强软骨细胞自噬水平，提高细胞活性，抑制细胞凋亡相关：①改良Videman法较传统Videman法能提高造模的成功率和一致性；②针刀组可增宽关节间隙，减少关节腔积液，改善软骨病理形态，显著改善KOA兔患膝行为能力；③针刀可增强原代软骨细胞自噬水平，提升细胞活性，降低细胞凋亡率；④针刀能上调 Beclin1、Bcl2，下调Caspase3 ，增强软骨细胞自噬水平，减少软骨细胞凋亡，进而延缓软骨退变和改善关节行为能力。.本研究成果为经筋理论指导针刀治疗KOA的临床应用提供理论依据和实验基础。