内侧前额叶皮层组蛋白去甲基化酶KDM7A对吗啡成瘾记忆调控机制研究

Opioid addiction is a public health issue worldwide. The key epigenetic modification enzymes, which normally function during neurodevelopment and differentiation, contribute to drug-associated reward memory. Our preliminary data showed that the histone demethylase KDM7A expression in the medial prefrontal cortex (mPFC) increased after morphine exposure; however, the mechanisms involved in this change are unknown. In this project, we utilize conditioned place preference (CPP) in mice to obtain the expression levels of KDM7A at different addiction periods. Using stereotaxic cannula implantation and microinjection of selective KDM7A inhibitor into the mPFC, we aim to decipher the role of KDM7A at different stages of addiction memory; using RT-PCR, Western blotting and Chromatin Immunoprecipitation, we will reveal the potential downstream molecular pathway (H3K27me2/NR2B); using patch clamp recordings, we further confirm the effect of KDM7A on NR2B-mediated synaptic function. Combining D1/D2-Cre transgenic mice and Cre-dependent Kdm7a-shRNA microinjection, which specifically inhibit KDM7A expression on D1 or D2 neurons in the mPFC, we will investigate the mechanisms of how KDM7A cell type-specifically affects morphine-associated memory in the mPFC. This study will not only provide new epigenetic evidence to morphine addiction, but also identify a new target for addiction treatment.

阿片成瘾是世界性公共卫生问题。神经发育和分化过程中关键的表观修饰酶参与调控药物诱导的奖赏记忆。预实验发现，吗啡暴露后内侧前额叶皮层(mPFC)组蛋白去甲基化酶KDM7A显著上调，但作用不明。本课题采用条件性位置偏爱(CPP)模型，观察成瘾不同阶段KDM7A表达情况；利用脑立体定位术在mPFC内注射KDM7A抑制剂，观察行为学变化，明确KDM7A在CPP不同阶段的作用；采用RT-PCR、ChIP等技术，明确下游可能的调控信号通路（H3K27me2/NR2B）；采用脑片膜片钳，验证KDM7A对NR2B所介导突触功能的影响；采用D1/D2-Cre转基因小鼠和Cre依赖的Kdm7a-shRNA病毒注射，选择性抑制mPFC内D1或D2神经元KDM7A表达，明确mPFC内KDM7A对吗啡记忆调控的神经元特异性。本项目不仅为药物成瘾的表观遗传学研究提供新的科学证据，也为成瘾治疗提供新的靶点。

项目的背景：.药物滥用和成瘾是目前世界范围内最严重的公共卫生问题之一。阿片类药物是临床上最强大也是最常用的镇痛药物，长期使用易引起药物成瘾并导致过量。成瘾是一种慢性复发性脑疾病，探索成瘾的神经生物学机制，为成瘾治疗提供新的科学证据显得极为迫切。啮齿类动物的转录组学数据显示，阿片暴露后前额叶皮层内KDM7A基因表达显著升高，但作用和机制不清楚。.主要研究内容：.本课题采用条件性位置偏爱（CPP）模型，观察成瘾不同阶段KDM7A的表达情况；利用脑立体定位术在mPFC内注射KDM7A干预病毒，明确KDM7A在CPP特定阶段的作用；利用三代转录组测序技术，生信分析并验证下游可能的调控信号分子，确定下游关键靶基因FSCN1；采用脑立体微量注射技术，mPFC内注射FSCN1干扰病毒，明确FSCN1调控吗啡成瘾记忆。.重要结果和关键数据：.PCR结果显示，吗啡组戒断3天和7天后，mPFC脑区KDM7A的mRNA均显著升高，而伏隔核、背侧纹状体及海马中KDM7A的mRNA变化不显著。Western blotting结果显示，mPFC的KDM7A蛋白在吗啡戒断3天后表达升高；KDM7A蛋白7天达到峰值；小鼠自然戒断30天，吗啡组与盐水组mPFC中KDM7A蛋白无显著差异，以上结果表明，吗啡成瘾后KDM7A表达具有时间和空间特异性。吗啡戒断7天后mPFC内H3K9me2蛋白表达量升高，而H3K27me2无显著变化，提示KDM7A可能通过H3K9me2调控成瘾。mPFC内注射KDM7A干扰病毒，CPP结果显示，KDM7A干扰病毒并不影响吗啡诱导小鼠CPP的形成，但KDM7A干扰病毒显著减弱小鼠对伴药箱的偏好，抑制吗啡成瘾记忆的巩固。小鼠mPFC脑区注射KDM7A干扰病毒，使用吗啡诱导形成CPP并自然戒断7天，分离mPFC组织，测序技术检测并分析差异转录本，差异转录本与已知吗啡成瘾通路高度重合；PCR进一步验证发现肌动蛋白结合蛋白1（FSCN1）可能是KDM7A下游靶基因。构建FSCN1敲低病毒，行为学结果显示FSCN1干扰病毒显著减弱CPP分数，减弱吗啡成瘾记忆。以上结果证明，KDM7A通过下游靶基因FSCN1调控成瘾记忆。.科学意义：.本项目不仅为药物成瘾的表观遗传学研究提供新的科学证据，也为成瘾治疗提供新的靶点。