万古霉素耐药：VanX抑制剂类D-ala-D-ala次膦酸盐和膦酸酯的结构优化、活性及与靶酶作用的光谱表征研究

本项目对万古霉素耐药机理进行了深入细致的分析，确立VanX为耐药研究的靶酶；对靶酶的结构及靶酶与底物反应的专一性进行了剖析，确立D-Ala-D-Ala二肽类似物为VanX的靶向抑制剂；对报道的竞争型抑制剂的结构与活性进行了归纳总结，确立β碳上的取代基是抑制剂结构优化的关键部位。本项目将含耐药基因vanX的质粒pIADL14植入大肠杆菌，进行表达纯化获得靶酶VanX；设计合成在β碳上引入结构多样性的脂肪烃和芳香烃基团，进行类D-Ala-D-Ala次膦酸盐和膦酸酯抑制剂的结构优化，用稳态动力学方法评估其活性，确定抑制剂质体的表观构性关系；使用快速冷冻萃灭反应技术和NMR、EPR光谱技术，测定抑制剂分子在VanX活性中心的位置及取向、考察VanX的亲水性和疏水性区域的功能，研究并揭示抑制剂与靶酶的键合机制，进而发展紧密键合型的可用于临床的VanX抑制剂，获得万古霉素耐药研究的突破性进展。

D-ala-D-ala二肽酶VanX是格兰氏阳性菌耐万古霉素之靶蛋白。因此，开展类D-ala-D-ala 的VanX抑制剂的结构优化、活性及与靶酶作用的光谱表征研究，对治疗耐药细菌感染的化学药物设计有重要意义。为此，本项目开展了一系列工作：1) 在大肠杆菌中表达并纯化出VanX，对其结构和活性进行了光谱和动力学表征。2）设计和合成了一系列类D-ala-D-ala的次膦酸盐和膦酸酯化合物，发现这些化合物对VanX有良好的抑制活性，其IC50值为毫摩尔级，确定了酶抑制剂质体的构效关系是，β碳上的取代基越小，其对VanX的抑制活性越强。3）开展了VanX催化D-Ala-D-Ala水解的热力学研究，建立了一个用于金属酶水解反应的热力学模型。4）以该模型探索了金属β-内酰胺酶催化抗生素水解的热力学行为，获得了反应的表观活化能，活化自由能，活化焓和活化熵等热力学参数。5）设计合成了一系列N-杂环二羧酸衍生物，发现这些化合物是所有B亚族金属β-内酰胺酶CcrA, ImiS 和L1的广谱型竞争性抑制剂，其抑制常数达微摩尔级。6）合成了具有光动力学活性的“荧光万古霉素”和 “荧光头孢菌素”，这些“荧光抗生素”对耐药细菌枯草杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌及其耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有显著的光动力学灭活效能，其最高灭活率达84%。我们的研究结果揭示了类D-ala-D-ala 次膦酸盐和膦酸酯型VanX抑制剂的构效关系对有效抑制耐药细菌的重要性，为应对超级细菌的感染提供了有意义的理论指导。