受体tolDC诱导的供体MHC-I抗原特异性Treg诱导同种异体器官移植免疫耐受

Induction of donor specific immune tolerance remains the most effective way to avoid rejection post-transplantation. Donor MHC-I-specific Treg induced by recipient APC presenting donor MHC-I epitope through the indirect recognition pathway can induce long-term immune tolerance post-transplantation. However, an effective and simple method for the Treg induction remains to be developed. Previous research shows porcine in vitro transcribed mRNA (ivt-mRNA) loaded human or non-human primate tolerogenic dendritic cells (tolDC) generated with our fast 3 day method could induce porcine-specific Treg with highly suppressive activity toward porcine antigen in xeno-transplantation. Based on this method, we want to establish a new donor MHC-I-specific Treg induction method in allo-transplantation. Initially, tolDC will be generated by our fast 3 day method using recipient mice bone marrow cells, then donor MHC-I ivt-mRNA will be loaded into recipient tolDC to induce donor MHC-I expression, processing and presentation on recipient tolDC, subsequently donor MHC-I-specific Treg will be induced using this tolDC in the supplement with IL-2 and rapamycin. The plasticity and antigen-specific suppressive activity of donor MHC-I-specific Treg will be evaluated in vitro and in vivo. Taken together, we aim to develop a novel method for generation of donor MHC-I-specific Treg, and provide new insights to the immune tolerance induction treatment for allo-transplantation.

诱导供体器官免疫耐受是器官移植的理想策略。在同种异体移植中，利用递呈供体MHC-I抗原的受体抗原递呈细胞可诱导生成MHC-I抗原特异性Treg，该类Treg可诱导长期移植免疫耐受。然而，目前仍缺乏简单高效且适用于临床的该类Treg制备方法。申请人前期研究证实，转染异种抗原体外转录mRNA的受体免疫耐受性树突状细胞（tolDC）可表达递呈异种抗原并高效诱导异种抗原特异性Treg。因此，本研究拟在该方法基础上，开发一种新的MHC-I抗原特异性Treg制备方法，即通过独创方法3天快速制备受体tolDC，并将供体MHC-I的体外转录mRNA转染入上述tolDC，使其在tolDC中表达递呈，进而用该tolDC诱导产生供体MHC-I抗原特异性Treg，并基于细胞实验及小鼠同种异体皮肤移植模型，系统研究该Treg的体内外稳定性及其特异性免疫抑制功能，为新型同种异体移植免疫耐受诱导疗法的开发提供有益参考。

诱导供体器官免疫耐受是器官移植的理想策略。在同种异体移植中，利用递呈供体MHC-I抗原的受体树突状细胞（DC）可诱导生成供体MHC-I抗原特异性Treg，该类Treg可诱导长期免疫耐受。目前该类Treg的制备多使用经辐射后的供体细胞或基因工程方法制备的MHC-I抗原肽作为抗原，导致该类Treg的制备过程复杂、周期长、成本高，从而不适用于大规模临床应用。因此，亟待开发一种简单、高效且具有良好临床转化潜力的供体MHC-I抗原特异性Treg诱导方法。本项目通过独创方法3天快速制备受体免疫耐受性DC（tolDC），以供体MHC-I体外转录mRNA（ivtRNA）作为“供体细胞”或“MHC-I抗原肽”的替代物，经转染后使其在受体tolDC上表达递呈，并通过该tolDC筛选扩增供体MHC-I抗原特异性Treg。该方法具有操作简单、周期短、成本低等优点。具体地，以GM-CSF与IL-4为基础，添加IL-10与TGF-β配制细胞因子鸡尾酒，以C57BL/6（B6）小鼠的骨髓单核细胞为前体细胞，通过3天逐级诱导法制备了tolDC，并表征了其细胞表型与细胞因子分泌水平，确定了其致免疫耐受特性与稳定性；以含有BALB/c小鼠MHC-I分子（Kd）序列的质粒为模板，体外转录获得大量Kd ivtRNA，并转染至tolDC内，通过流式细胞术确定了Kd抗原的表达递呈；然后，将该Kd tolDC与小鼠Treg细胞共孵育，扩增获得了Kd抗原特异性Treg细胞（B6Treg），并在体外抑制试验与小鼠皮肤移植模型中确定了B6Treg的供体抗原特异性抑制效果。综上，本项目提供了一种简单、高效的供体MHC-I抗原特异性Treg制备方法，为新型同种异体移植免疫耐受诱导疗法的开发提供了新的路径及思路。本项目顺利完成了预期研究任务，共发表学术论文3篇，申请中国发明专利1项，培养硕士研究生2名。