水稻非胚乳表达启动子OsTSP I调控机理研究

The strategy using tissue-specific promoter to express exogenous gene in rice roots, stems, leaves and other organs while not in rice endosperm for human consumption can improve the edible safety of genetically modified rice. We successfully cloned a promoter OsTSP I in the preliminary experiments, which could express GUS and Cry1Ab gene in rice roots, stems and leaves but not in endosperm, whose utilization can reduce the consumption risk of genetically modified rice, but the molecular regulation mechanism of its non-endosperm expression is still unclear. In this study, on one hand, we attempt to clone the cis-regulatory elements determining non-endosperm expression of the promoter by deletion mutation analysis and integrate the cis-regulatory elements with CaMV35S promoter and CaMV35S core area to verify its effect on endosperm expression mode; on the other hand, we attempt to obtain the trans-acting factors by using yeast one-hybrid technology to analyze the expression specificity of the trans-acting factors. Their mutual verification can reveal the molecular regulation mechanism of non-endosperm expression. The study can rich the theory of gene expression and regulation, assist to use this kind of promoter efficiently in transgenic breeding and design new non-endosperm expression promoters.

利用特异性表达启动子策略，使外源基因在水稻的根、茎、叶等器官中表达，而在人类食用的胚乳中不表达，可提高转基因大米的食用安全性。项目组在前期工作中成功克隆一该类启动子OsTSP I，该启动子可以使GUS和Cry1Ab基因在水稻根、茎、叶中表达，而在胚乳中不表达，该启动子的使用可以降低转基因大米的食用风险，但其非胚乳表达的分子调控机理仍不清楚。本研究一方面通过启动子缺失突变分析，克隆出该启动子内决定非胚乳表达的顺式作用元件，并将顺式元件分别与CaMV35S启动子和CaMV35S核心区融合，验证其对CaMV35S表达的影响；另一方面利用酵母单杂交技术获取顺式元件的反式因子，并分析反式因子空间表达特异性；两方面相互验证，揭示非胚乳表达分子调控机理。该研究有助于丰富基因表达调控的理论内容，将为该类型启动子更好地在转基因育种中的利用提供理论依据和技术保障，为人工设计胚乳表达可控的新型启动子奠定基础。

LOC_Os01g42520基因表达具有组织特异性，其启动子OsTSP I能驱动GUS和mCry1Ab在根、茎、叶、花、颖壳和胚中表达，而在胚乳（大米）中不表达，这种非胚乳表达的特性可用于降低转基因作物的食用风险。本项目着重分析OsTSP I启动子驱动外源基因在非胚乳组织中表达的分子调控机理。首先，项目组进行了两轮启动子截短分析，第一轮5’端截短分析发现，当OsTSP I启动子被截短到-1100bp时，GUS在转基因水稻各器官中的表达消失；但是，当启动子继续被截短到-100bp时，GUS在各器官中表达恢复，包括胚乳。序列分析发现该片段在-31bp处含有TATA box元件，为RNA聚合酶II的常见识别位点。据此，我们推测OsTSP I启动子在-1500bp~-1100bp之间，含有决定非胚乳表达的顺式元件；-31bp位置含有RNA聚合酶II的结合区；在-200bp~-100bp间含有抑制RNA聚合酶II活性的抑制子；-1500bp~-1100bp之间的顺式元件能解开抑制子的抑制作用。针对-1500bp~-1100bp片段的第二轮截短分析发现：当启动子被截短到-1450bp时，启动子的表达活性就全部消失，说明在-1500bp~-1450bp这50bp的DNA片段中含有候选顺式元件。序列分析发现，这50bp中含有7类顺式元件，其中的GATA box已被报道具有受光诱导和组织特异性表达的功能，为此我们检测了LOC_Os01g42520和OsTSP I::GUS转基因水稻中GUS基因在光和暗条件下表达情况，发现在OsTSP I驱动下的两基因均具有光诱导表达特性。我们又对OsTSP I启动子中的GATA box进行了突变处理，结果突变的启动子无法使GUS基因在光下表达。随后，我们克隆了已报道的水稻中识别该GATA box的7个反式因子，酵母单杂交和EMSA均揭示反式因子LOC_Os02g12790能特异性识别该GATA box，烟草体内试验也验证了LOC_Os02g12790能增加OsTSP I的表达量。各器官表达谱分析发现LOC_Os02g12790也具有非胚乳表达特性，与LOC_Os01g42520相似。所以，OsTSP I启动子是由于其-1500~-1450bp位置的GATA box被LOC_Os02g12790特异性识别，使其具备光诱导和非胚乳表达的特性。