无柄灵芝调控CCL2分泌抑制乳腺癌微环境Tregs招募的抗肿瘤机制

Immune tolerance is the biggest obstacle to tumor immunotherapy. However, tumor immunosuppressive microenvironment is the key factor leading to immune tolerance. Many evidences show that Tregs is an important component of tumor immunosuppressive microenvironment. CCL2 is a key molecule in the recruitment of different myelogenous cells to inflammatory tissue. The previous study found that, The Ganoderma resinaceum has the same anti-tumor effect as cyclophosphamide, and can significantly reduce the amount of Tregs and the content of CCL2 in the tumor microenvironment. Therefore, we speculate that the Ganoderma resinaceum may play an anti-tumor role by regulating the secretion of CCL2 and inhibiting Tregs recruitment. We first observed the antitumor mechanism of Ganoderma resinaceum by using PyMT、PyMT Parp-/-and other transgenic mice and Parp-/- macrophages,tumor cells in vivo and in vitro. the effects of Ganoderma resinaceum on the secretion of CCL2 by various cell groups in tumor microenvironment including tumor cells and macrophages by flow cytometry.CCL2 antibody was used to observe the effect of CCL2 on Tregs recruitment in breast cancer microenvironment and to elucidate the mechanism of CCL2 secretion regulated by PARP1.The expected results of this project will clarify the anti-tumor pathway of Ganoderma resinaceum ,reveal its anti-tumor immune mechanism, and provide the basis for the design of a new and effective combination of tumor immunotherapy in the future.

免疫耐受是当前肿瘤免疫治疗最大的障碍，而肿瘤免疫抑制微环境是导致免疫耐受的关键因素。众多证据显示，Tregs是肿瘤免疫抑制微环境的重要组成部分，CCL2是招募不同髓来源细胞至炎症组织的关键分子。课题组前期研究发现，无柄灵芝具有与环磷酰胺相当强的抗肿瘤作用；能显著降低肿瘤微环境Tregs数量和CCL2含量。因此我们推测无柄灵芝可能通过调控CCL2分泌抑制Tregs招募而发挥抗肿瘤作用。为此，我们首先采用PyMT、PyMT Parp-/-等小鼠及Parp-/-细胞体内外观察无柄灵芝抗肿瘤的作用机制，流式检测无柄灵芝对肿瘤微环境细胞群包括肿瘤细胞、巨噬细胞等分泌CCL2的影响；采用CCL2抗体观察CCL2对乳腺癌微环境中Tregs招募作用；阐明无柄灵芝通过PARP1调控CCL2分泌的机制。本项目预期将明确无柄灵芝抗肿瘤作用，揭示其抗肿瘤免疫机制，为今后设计新型有效的肿瘤免疫治疗联合方案提供依据。

目前已有多个权威研究证实是Tregs是介导肿瘤免疫耐受及阻碍肿瘤免疫治疗发展的关键因素。因此，迫切需要通过提高肿瘤微环境的免疫治疗耐受性来确定更有效的治疗方法和药物。本研究通过构建多种乳腺癌模型或荷瘤小鼠等，以及PARP1基因缺失的小鼠模型深入研究无柄灵芝的抗肿瘤作用以及机制探讨。在此基础上进一步利用高效液相和制备液相对无柄灵芝中若干分离组分，完成体内药理作用的筛选、评价，并结合体外各组分评价结果，明确无柄灵芝抗肿瘤作用的主要药效成分。通过研究发现：（1）GS能够有效抑制不同三阴性乳腺癌小鼠模型肿瘤的生长，并主要通过免疫系统发挥作用。GS是一种免疫增强药物，在抑制4T1-Luc乳腺癌小鼠肺转移和延长寿命方面明显优于环磷酰胺，且完全治愈率为10%。这为GS在临床实践中指导辅助抗肿瘤作用提供了重要的指导依据。（2）在肿瘤免疫环境中，GS具有促进肿瘤CD4+T细胞浸润，抑制调节性T细胞（Treg）和髓源性抑制细胞（MDSC）减少。髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Tregs）在肿瘤微环境中具有免疫抑制功能。因此，GS能够增强免疫应答，并且主要通过去免疫抑制作用发挥抗乳腺癌作用。（3）转录组测序及组织验证中，GS显著降低肿瘤中CCL28，Cxcl13，CCL17，CCL9等趋化因子表达。同时发现CCL28及其受体CCR10、CCL17及其受体CCR4和CCL9及其受体CXCR3显著下调。我们还发现，肿瘤组织中下降程度最多的趋化因子与Treg募集密切相关。GS通过调控免疫相关趋化因子的分泌，尤其是CCL28，抑制Tregs招募从而发挥抗肿瘤的作用。