Nrf2在卤代乙腈类消毒副产物致人皮肤细胞毒性中的作用及机制研究

Haloacetonitriles (HANs) DBPs, which shown much higher toxicity than Trihalomethans (THMs) and Haloacetic acids (HAAs) on Chinese hamster ovary (CHO) cells, the human skin permeability and potential to promote skin tumor in mice, rank the most common and highest content nitrogen-containing DBPs (N-DBPs) in swimming pool, but the laboratory study on HANs’ toxicity effect on human skin cells is lacking. In our previously study, the results demonstrated all of the HANs DBPs activated the transcription factor NF-E2-related factor 2 (Nrf2) pathway, and this might suggest that oxidative stress is intimately involved in the mechanism of HANs’ toxicity effect on HaCat cells. For that reason, this study is employing the actual dose and the multiples of these actual doses based on the field data collected from the measurements of water samples from swimming pool, with applying the mode of mixture exposure to treat the human HaCat cells, to evaluate the cytotoxicity and genotoxicity of HANs DBPs. Nrf2 is among the most critical nuclear transcription factors against the cellular oxidative stress, moreover, increasing evidence has shown its highly expression is also associated with various toxicology mechanisms. Therefore, we will further investigate the role of Nrf2 in cytotoxicity, genotoxicity and the effect of malignant transformation of HANs DBPs, and its mechanism by using stable Nrf2 knock down cell line. Our research will enhance the understanding on the mechanism of HANs’ toxicity effect, and provide the scientific evidence for the development of swimming pool and recreational water DBPs related management and strategies for public health.

卤代乙腈类（HANs）消毒副产物（DBPs）是游泳池水中含量最高、对人群健康的潜在危害最大的含氮DBPs，其对中国仓鼠卵巢细胞CHO的细胞毒性比三卤甲烷类和卤乙酸类DBPs高数百倍，易于渗透人皮肤，且可致小鼠皮肤肿瘤，但它对人皮肤毒效应及其机制尚未见研究。我们在预实验中发现HANs可激活人源性HaCat细胞Nrf2通路，提示氧化应激可能是其细胞毒性作用机制之一。因此，拟在现场实测基础上，以HANs现实剂量和不同倍别现实剂量，并结合混合暴露模式，对人源性HaCat皮肤细胞的细胞毒性、遗传毒性及其作用机制进行研究。由于Nrf2是细胞内参与抗氧化应激的最重要核转录因子，与多种毒效应机制有关，故拟以Nrf2基因沉默细胞进一步分析探究Nrf2在HANs的细胞毒性、遗传毒性及皮肤细胞恶性转化中的作用。研究结果将增进对HANs毒效应机制的理解，为游泳池水中DBPs相关管理和决策的制定提供科学依据。

在本项目中，我们着重探讨了7种卤代乙腈类（Haloacetonitriles，HANs）消毒副产物是否导致人皮肤细胞氧化应激，以及Nrf2信号传导通路的相关调控机制。结合近年来国际毒理学界提出的“Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a s trategy (Tox-21c)”（21世纪毒性测试：战略与远景）的相关理念与研究策略，我们通过应用永生化的人皮肤角质细胞（HaCat）来检测细胞毒性、氧化应激标志物以及Nrf2信号传导通路的活化，系统地分析了7种HANs对皮肤细胞的潜在细胞毒性。我们发现：HANs的暴露可以导致皮肤细胞毒性，刺激ROS的生成，促使SOD活性升高，增加GSH水平，并诱导Nrf2蛋白聚集表达。此外，7种HANs均可以增强稳定转染ARE-luciferase报告基因的HaCat细胞的ARE活性，并促进了Nrf2下游基因的表达，且呈现时间-效应，剂量-效应关系，提示Nrf2信号传导通路被激活。我们还应用Nrf2基因沉默细胞（Nrf2-KD细胞）探讨了Nrf2在HANs诱导的细胞毒性中的保护作用，为研究Nrf2调控的氧化应激在HANs诱导的皮肤细胞毒性中的作用提供了实验证据。根据在人源性HaCat细胞中的发现，我们确定了毒性最强的三种HANs类化合物，即溴乙腈（BAN）、二溴乙腈（DBAN）和碘乙腈（IAN），并结合文献报道确定了游泳池中检出率最高、浓度最高的二氯乙腈（DCAN），对它们的细胞毒性与相关机制进行拓展研究。我们使用了3种人源性肝细胞（包括人肝肿瘤细胞HepG2，人正常肝细胞Chang liver和人胚胎肝细胞LO2）作为研究对象，观察三种消毒副产物对人代谢器官细胞的毒性作用及其可能机制。我们发现，三种消毒副产物均可以导致肝细胞毒性，激活ARE并造成细胞氧化应激，提示HANs类消毒副产物可能对人体重要代谢器官导致潜在氧化损伤。在开展实验室研究的同时，我们还对近年来游泳池消毒副产物相关研究作以系统综述，以期为后续的研究方向与热点的选择提供信息支撑。综上，本项目研究为进一步探讨氧化应激在HANs诱导的细胞毒性中的作用提供了系统详实的实验室基础数据。