黄柄曲霉产细胞松弛素二聚体黄柄霉素A的生物合成研究

A series of isoindolone paralleled macrocyclic skeletons named cytochalasans from funguses attract much attentions by natural medicine researcher due to their unique structures and significant bioactivites. Asperchalasine A, the first dimer cytochalasan in the nature isolated from the fungus Aspergillus flavipes can induce significant G1-phase cell arrest in cancerous, but not normal, cells. Although medicinal potential asperchalasine A has, the relatively low yield hinders the further development and application. It is the fact that either chemial synthesis of asperchalasine A or traditional mutagenic selection of high yield mutant runs into difficulties. In this project, as an alternative, we study on the biosynthesis and regulation mechanism of asperchalasine A in Aspergillus flavipes, with the purpose to establish a site-derected breeding strategy bsed on the characterization of biosynthesis gene cluster. Firstly, the screening and cloning of the asperchalasine A biosynthetic gene culsters are performed on the basis of genome, transcriptome and metabolome analyses of Aspergillus flavipes. The second, integrate appraches, such as gene deletion, over-expression in producing strain, as well as heterologous expression candidate genges in the yeast were applied to identifiy the functions of the key genes invovled in the asperchalasine A biosythesis and regulation. As is described, this project studys on the biosynthesis and regulation mechanism of asperchalasine A, which provides scientific evidences for Aspergillus flavipes molecular breeding to improve the yield of asperchalasine A. In addition, the characterization of asperchalasine A biosynthetic gene clusters shows clues for discovering and refactoring biosynthtic pathway in other fungi to obstain novel bioactive cytochalasan derivates.

细胞松弛素是一类具有异吲哚酮骈合大环骨架的真菌次生代谢产物，其独特的结构和显著的生物功能引起了天然药物研究者的关注。黄柄曲霉素A是从真菌黄柄曲霉中分离得到的自然界首个细胞松弛素二聚体化合物，能显著地诱导癌细胞的细胞周期G1期停滞，却不影响正常细胞的生理功能，具有巨大的药用潜力，但产量相对较低，影响进一步的开发应用。为了突破黄柄曲霉素A化学合成难度大，传统诱变选育高产菌株效率低的限制，进而建立以黄柄曲霉素A生物合成基因簇及其代谢调控机理为前提的定向育种方法，本项目拟在黄柄曲霉基因组、转录组、代谢组的基础上，筛选、克隆黄柄曲霉素A合成基因簇。通过目的基因缺失、过表达及异源表达，结合产生菌的生物学特性及细胞松弛素代谢产物的分析，确定基因簇中与黄柄曲霉素A合成相关的关键合成及调控基因。项目研究成果为利用定向育种和代谢工程技术提高黄柄曲霉素A产量或获得更高活性的细胞松弛素衍生物提供理论与技术支持。

黄柄曲霉素A（asperchalasine A）是从丝状真菌黄柄曲霉中分离得到的自然界首个细胞松弛素杂二聚体化合物，具有巨大的药用潜力，但产量相对较低，影响进一步的开发应用。为了突破黄柄曲霉素A原料获取途径的限制，我们对黄柄曲霉素A的生物合成机制开展研究。. 通过生物信息分析和基因敲除技术，我们确定了基因簇Afcha和epi参与黄柄曲霉素A的生物合成。根据生物合成路线的推断，黄柄曲霉素A的生物合成需要两个关键的中间体：细胞松弛素亲双烯体和epicoccine双烯体，阐明这两个中间体的生物合成机制为本研究的关键。根据项目研究计划，我们一方面对两条基因簇中预测的关键合成基因进行敲除，确定了Afcha簇中合成细胞松弛素亲双烯体aspchalasin B的基因AF_09378。同时，我们对epi基因簇中预测的双烯体及杂聚体合成基因进行逐一敲除，通过LC-MS靶向分析突变株的代谢产物发现，敲除AF_00467（dehydrogenase）、AF_00474（laccase）的突变株产细胞松弛素杂聚体能力大大降低。而且，我们还发现这两个突变株产epicoccine二聚体的合成的能力也随之降低，这个结果表明这两个基因可能是参与epicoccine双烯中间产物和DA聚合反应的关键基因。另一方面，我们在米曲霉中异源表达epi簇中核心基因AF_00464（PKS）、00465（NRPS-like）、00466（P450）、00467、00470（FAD oxidase）、00474，生成了epicoccine内酯及二聚体。.此外，我们还采用基因组扫描的策略，以黄柄曲霉细胞松弛素生物合成PKS-NRPS基因为探针，从药用植物叶下珠内生真菌中发现具有产细胞松弛素潜力的曲霉真菌A. micronesiensis。通过大规模的大米发酵培养，从A. micronesiensis中分离鉴定了71个以亮氨酸骨架细胞松弛素类化合物，其中新化合物45个，包括17个新的骨架。. 以上研究部分阐明了黄柄曲霉素A生物合成途径机制。同时，构建的米曲霉过表达菌株为后续通过底物饲喂研究细胞松弛素杂聚体的形成和组合生物合成新颖细胞松弛素杂聚体提供了实验工具。基于合成生物学技术的细胞松弛素挖掘，一方面丰富和活性天然产物候选分子库，另一方面，为精准和快速发现新颖产物提供了参考。.