水稻转录因子Roc8调控叶片卷曲及形态建成的分子机制研究

In rice breeding, leaf rolling is receiving considerable attention as an important agronomic trait of plant architecture. However, little has been known on the molecular mechanism of rice leaf rolling. Previous study had reported that the Homeodomain Leucine Zipper Class IV transcription factor Roc5 controlled leaf rolling in rice. We isolated Roc8, a homologous protein of Roc5, by phylogenetic analysis and sequence analysis. It has been proved that Roc8 can interact with Roc5 by Y2H and BiFC analysis, which confirms that Roc proteins can form heterodimers in rice. Transformation analysis has shown that overexpression of Roc8 induces adaxially curled leaf, while knock-out of Roc8 causes abaxially rolled leaf, indicating that Roc8 plays an important role in rice leaf rolling and morphogenesis as well. By genetics and molecular biology methods, we plan to study the gene features and the function in rice, and further explore the leaf rolling regulation by the interaction between Roc8 and Roc5 to investigate the function and molecular mechanisms of Roc8 in leaf rolling regulation. This study may be beneficial for expanding our knowledge on the biological function of the Roc family proteins in rice leaf rolling and morphogenesis, and providing new genetic resources and theoretical basis for improving the plant architecture in rice.

在水稻育种中，株型是决定产量的重要因素，卷叶作为决定株型的重要农艺性状之一越来越受到育种家们的重视。但是，水稻叶片卷曲的分子机制仍不明确。前人研究表明HD-Zip IV类转录因子Roc5对于叶片卷曲起着重要的作用。本研究前期通过聚类分析和序列比对，鉴别得到Roc5的同源蛋白Roc8。Y2H和BiFC实验表明Roc8能够与Roc5互作，验证了Roc转录因子间能形成异源二聚体。遗传转化实验发现，该基因过表达和敲除分别导致叶片向近轴面和远轴面卷曲，证实其对于叶片的卷曲及形态建成同样起着重要的作用。本研究拟利用分子生物学和遗传学等实验方法，从基本特性分析，水稻中的功能验证以及与Roc5共同调控水稻叶片卷曲等方面对Roc8展开更为深入的研究，以期揭示Roc8调控叶片卷曲的分子机制。本研究将有利于进一步阐明该类转录因子对于水稻叶卷控制及叶片形态建成的分子机制，为改良水稻株型提供新的基因资源和理论依据。

水稻是我国重要的粮食作物。水稻株型指标中卷叶是重要的农艺性状之一，深入探究叶卷控制的分子机制将有助于水稻育种家在育种过程中通过生物设计对叶型和株型进行改良，实现高效育种目的。前人研究报道，HD-Zip IV类转录因子Roc5对于叶片卷曲起着重要的作用。本研究鉴别得到Roc5的同源蛋白Roc8。Roc8基因呈组成型表达模式，其蛋白产物定位于细胞核中。实验表明Roc8和Roc5都具有转录激活活性，且各自都能形成同源二聚。遗传转化实验发现Roc8过表达导致叶片向近轴面卷曲，基因敲除导致叶片向远轴面卷曲，细胞学观察表明其通过调控泡状细胞大小和数量来控制叶片卷曲。分子生化实验表明Roc8能够与Roc5互作形成异源二聚体，其中Roc8中202-710aa的START-ArGLABRA2-like+CTR区域及Roc5中单独的M区或者START-ArGLABRA2-like+CTR区域是两者互作所必须的。进一步，该Roc5-Roc8异源二聚作用与Roc5或Roc8各自的同源二聚作用都存在竞争关系。此外，遗传转化实验发现在Roc5T-DNA插入突变体oul1中过表达Roc8或者在Roc8敲除突变体中过表达Roc5都没有出现叶片正卷的表型。利用基于Crispr-Cas9的基因编辑技术创制了roc5roc8双敲除突变体，该双突变体同样出现了叶片反卷的表型。利用该双突变体及其野生型Kitaake进行转录组分析，成功检测到较多的差异表达基因，且聚类相近的差异表达基因具有较为相似的表达行为，差异表达基因背景和全部基因背景下GO大部分二级功能的基因富集具有明显比例差异。综上所述，Roc8通过与Roc5互作协同调控水稻体内下游相关基因的表达，影响泡状细胞的数目和大小，从而控制叶片的卷曲。本研究结果扩展了该家族生物学功能的认知，丰富了叶卷控制的分子理论。