蚊虫杀虫剂抗性关键micro-RNA基因的分离及功能鉴定

The mosquito-borne diseases including malaria, dengue fever are important infectious diseases in the world and caused serious threat to human health. Mosquito control is the main measure to combat mosquito-borne diseases. Chemical control, because of its killing speed, long-lasting and convenient features, has been the main method in the comprehensive management strategy. Unfortunately, excessive and continuous usage of insecticides induced the development and spread of resistance. .This study selected Culex pipiens pallens (Cx. pipiens pallens) as the research object which is widely distributed in the northern China. We will compare miRNA expression differences of deltamethrin-susceptible and –resistant strains by solexa sequence. PCR will be used to verify pre-miRNA. Quantitative PCR will further validate miRNA expression differences between resistant and susceptible strains. Target genes of microRNA will be predicted and luciferase report assay will be used to identify regulatory effect. .MicroRNA mimics will be supplied to mosquitoes by microinjection and biochemical assays was used to detect the sensitivity to deltamethrin of mosquitoes. Our study has important theoretical significance and potential practical value.

媒介蚊虫的化学防制是蚊媒病防治的主要策略。杀虫剂的大量使用导致蚊抗药性的产生和发展，其已成为蚊媒病防治中的突出问题。研究显示杀虫剂代谢相关酶活性的改变与蚊抗药性产生密切相关，这种酶转录水平的增高与转录调控因子有关，而抗性相关基因转录后调控与蚊抗药性形成的关系不明。本研究选取广泛分布的重要家栖病媒蚊种淡色库蚊为研究对象，以近年使用最多的卫生杀虫剂溴氰菊酯为材料，采用 solexa 测序法，比较溴氰菊酯敏感和抗性淡色库蚊 miRNA 表达谱。用 PCR 鉴定 miRNA 的前体结构，运用实时定量PCR 对测序结果进行验证，从中进一步筛选差异 miRNA；预测差异 miRNA的靶标分子，并进行荧光素酶检测确定 miRNA 调控作用，最终对成蚊进行显微注射miRNA mimic并进行成蚊接触筒实验，以期为 miRNA 参与蚊抗药性提供实验依据，从而进一步阐明蚊虫抗药性分子机理。

蚊虫传播疟疾、登革热等许多蚊媒传染病，严重危害人类健康。化学防治是蚊媒综合治理的主要方法。然而，长期大量、连续使用杀虫剂使得蚊虫的抗药性水平显著增加，加剧了蚊媒病的进一步传播。因此,蚊媒病防治的重点落在了蚊媒抗药性研究上。miRNA作为一类重要的转录后调控因子，通过与mRNA结合的方式来调节体内基因的表达水平。目前，昆虫中有关miRNA参与抗药性的研究多集中在组学方面，具体如何参与抗药性机制的研究则较少。本研究选取广泛分布的重要家栖病媒蚊种淡色库蚊为研究对象，以近年使用最多的卫生杀虫剂溴氰菊酯为材料，采用最新的测序法，比较溴氰菊酯敏感和抗性淡色库蚊 miRNA 表达谱。用 PCR 鉴定 miRNA 的前体结构，运用实时定量PCR 对测序结果进行验证，从中进一步筛选差异 miRNA；预测差异 miRNA的靶标分子，并进行荧光素酶检测定 miRNA 调控作用，最终对成蚊进行显微注射miRNA mimic并进行成蚊接触筒实验，以期为 miRNA参与蚊抗药性提供实验依据。研究结果表明：鉴定出保守 miRNA的数量为4364个，新miRNA的数量为514个。在淡色库蚊敏感及抗性品系三个发育龄期中，Ⅲ、Ⅳ龄幼虫以及雌蚊中上调表达的miRNA分别有44个，58个，45个；下调表达的miRNA分别有54个，45个、46个。在Ⅲ龄幼虫和雌蚊中，miR-278-3p_1、miR-8-5p在敏感品系中的表达量比抗性品系高，而miR-305-3p_5、miR-11-5p、miR-317_3在抗性品系中的表达量高于敏感品系；在Ⅳ龄幼虫中miR-11-5p、miR-317_3、miR-278-3p_1、miR-305-3p_5在抗性品系中的表达量相对较高，而miR-8-5p在敏感品系中的表达量相对较高。预测的靶基因的定量PCR分析发现：CYP6a8、CYP6N26P在三个龄期的表达情况与miR-11-5p、miR-8-5p相反，说明miR-11-5p、miR-8-5p可能通过分别调控CYP6a8、CYP6N26P的表达来参与蚊虫抗药性。用miR-11-5p和预测的靶基因进行荧光素酶检测及分析miRNA对淡色库蚊溴氰菊酯敏感性的影响，进一步提示miR-11-5p参与了蚊抗药性的形成。而这个过程是通过调控靶基因CYP6a8的表达来完成的，该研究结果也为进一步阐明抗药性的分子机制提供了科学依据。