Klotho调控老年梗死心肌血管新生及机制研究

血管新生障碍是老年缺血性疾病发生发展的病理生理基础。骨髓内皮祖细胞（EPC）可动员至外周血、归巢心肌损伤区域、分化为内皮细胞、新生血管。但是，我们发现老年鼠EPC细胞结构退行性变、端粒缩短，功能减退，归巢的EPC不能有效促进血管新生。Klotho(KL)蛋白是一种内源性类激素，可通过抑制胰岛素/胰岛素样生长因子1信号通路、增强机体抗氧化能力，预防衰老。课题组在预实验证实KL可促进EPC迁移、管型生成的基础上，拟进一步明确KL蛋白对EPC其他生物学功能的影响；另外，为保证在体研究中KL蛋白稳定及长效缓释，拟构建KL蛋白微囊并行骨髓腔注射，观察KL蛋白对EPC衰老，梗死区血管新生及心功能的影响；最后，探讨KL蛋白促进衰老EPC"年青化"的具体机制。本课题拟通过研究KL对EPC衰老及血管新生的调控作用，验证EPC衰老是年龄依赖性血管新生障碍发病机制的新理论，为缺血性疾病的防治提供一定的实验依据。

第一部分： 体外培养klotho基因敲除杂合子小鼠骨髓EPCs，培养 7 天的鼠骨髓单个核细胞呈梭形或纺锤状，并且呈现 acLDL-DiI摄取 和与 UEA-I 结合双阳性，流式细胞仪检测显示这些细胞高表达干细胞抗原 Sca-1、内皮特异性标记物 VEGFR-2 及CD31。EPCs迁移、粘附及增殖功能随着鼠龄的增加而受损，这种异常与老年鼠外周血及肾脏Kl蛋白水平降低密切相关。给予Kl蛋白则可改善EPCs的生物学功能。进一步研究发现发现klotho（+/-）小鼠骨髓EPCs数量较野生型小鼠明显降低，其增殖、粘附、迁移生物学功能明显下降。.第二部分：体外培养了人外周血的EPCs，鉴定发现呈acLDL-DiI摄取 和与 UEA-I 结合双阳性，提示为分化的EPCs。Kl蛋白处理可以明显增加CD34/CD31阳性EPCs数量，改善EPCs增殖、迁移、粘附的功能， Akt抑制剂可以抑制该效果。同时，促进EPCs分泌VEGF，SDF-1 和bFGF等细胞因子。在体实验发现Kl蛋白可以促进颈动脉损伤后小鼠外周血EPCs动员、归巢、增加外周血VEGF，SDF-1 和bFGF浓度，抑制新生内膜的增生，促进损伤血管再内皮化。同时，Kl蛋白可以促进人脐静脉内皮细胞HUVECs增殖、迁移、粘附能力，抑制其凋亡。Western-blot检测发现Klotho蛋白同样能够诱导VEGF的表达显著增加(P﹤0.01)，具有一定浓度效应，但其效应受AKT信号抑制剂的抑制。