二八占抗稻瘟病基因簇的构成及其功能研究

二八占对水稻稻瘟病菌具有广谱抗性，是华南抗病育种的骨干抗源，研究其抗稻瘟病基因的构成及功能，对抗性育种开展及探明真菌病害的持久抗病性分子机制有着重要意义。二八占基因精细定位及小种专化性抗性研究结果表明，其含有一个广谱抗病基因Pie1(t)，该基因是Pi2/Pi9座位上基因簇的新成员。本研究拟利用含Pie1(t)的近等基因系材料构建目的基因的BAC文库，通过共分离标记钓取包含目的基因的克隆进行测序并对其基因结构进行分析；利用Real-Time RT-PCR技术，分析不同时间段候选基因与病原菌互作的表达差异，确认候选基因的表达方式，缩小候选基因的范围；利用Long-Range PCR技术获得候选基因，通过双元载体转化体系pCAMBIA1300和pLYTAC27将候选基因转到感病受体品种日本晴等进行功能互补验证，分析Pie1(t)候选抗性基因的功能。

二八占对水稻稻瘟病菌具有广谱抗性，是华南抗病育种的骨干抗源，研究其抗稻瘟病基因的构成及功能，对抗性育种开展及探明真菌病害的持久抗病性分子机制有着重要意义。二八占基因精细定位及小种专化性抗性研究结果表明，其含有一个广谱抗病基因(Pie1)Pi50，该基因是Pi2/Pi9座位上基因簇的新成员。本研究以含Pie1的近等基因系材料为模板，通过包含目的基因约100kb区域，利用该区域日本晴基因组为参考序列，设计了70多对扩增1.5kb左右的片段，通过PCR产物或者克隆测序，获得了包含目的基因96kb的目标基因区域；利用FGENESH和RiceGAAS等软件对该区域进行序列分析，从目标区域获得了7个NBS-LRR结构基因组成的抗病基因簇；利用RT-PCR技术分析了不同时间段候选基因与病原菌互作的表达差异，结果发现Pie1-3、Pie1-5没有表达，其余5个候选基因都有不同程度的表达；对Pie1中不同旁系基因进行了转基因互补实验验证几个候选R基因的抗病功能，结果表明Pie1中具有2个高度保守的、可稳定遗传的广谱抗瘟基因（Pie1-NBS4与Pie1-NBS2）。Pie1-NBS4与Pie1-NBS2的T0和T1抗病性功能验证表明，Pie1-NBS4是最可能的目的功能基因。利用开发的Pie1抗病基因功能标记，通过基于分子标记辅助选择的基因转育获得了含Pie1基因的新品系黄粳占/Nil-Pie1、五丰B/Nil-Pie1、T78B/Nil-Pie1和潘B/Nil-Pie1等BC3F4纯合高代抗病稳定的保持系,为抗病基因应用奠定了良好基础。