带有分离肿瘤干细胞功能的纳米粒子对肿瘤MDR发生机制的研究

The strategies of overcoming cancer multidrug resistance (MDR) are not efficient enough to elicit clear mechanism. The conventional model of tumour-cell drug resistance is studied in the present strategies. Recent years, it was found the existence of cancer stem cell (CSC) may be an original reason of initiating MDR. Nanoparticles can bypass membrane resistance protein-mediated drug efflux mechanism to overcome MDR by its endocytosis effect and other nanoparticle-based approaches, such as specific targeting effect, etc. The CSC can be isolated by flow cytometry method based on fluorescent probe efflux mechanism, which is conferred partly by high levels of expression of membrane resistance proteins on CSC. Thus, the mechanism of isolated CSC is similar as that of nanoparticle overcoming MDR. To the best of our knowledge, no one has, thus far, explored nanoparticle reversion effect on CSC. Due to our previous work, herein, we will design functionalized polymeric nanoparticles with fluorescent probe. The flow cytometry experiment of CSC will be conducted in many types of cancer cells by nanoparticles and free fluorescent probe as control. The nanoparticle endocytosis and specific targeting effects will be analyzed, which is related with CSC membrane resistance protein-mediated efflux mechanism. The CSC properties of isolated subpopulations will be detected. The study will help us to further understand the resistance mechanism of CSC and develop new strategies for overcoming MDR.

目前在传统肿瘤细胞耐药模型上开展的肿瘤多药耐药（MDR）研究效果并不理想。肿瘤干细胞（CSC）作为产生MDR的根本原因，在MDR研究中显示出重要的临床价值。由于纳米粒子的内吞作用、靶向作用等能避免肿瘤细胞耐药蛋白泵出药物，因此纳米粒子可应用于MDR研究，这与以CSC耐药蛋白泵出特异荧光探针的流式分离CSC方法形成契合点，但迄今为止并未见相关的研究报道。基于我们在纳米粒子制备和分离CSC方面的经验，我们拟构建带有这种特异荧光探针的多功能聚合物纳米粒子，应用流式技术分别开展荧光探针和纳米粒子分离多种肿瘤细胞的CSC实验，对比游离荧光探针与纳米粒子分离的细胞亚群数量，考察纳米粒子的内吞作用、主动靶向作用等对CSC耐药蛋白泵出功能的影响，并检测分离的细胞亚群CSC特性。本申请通过研究CSC耐药蛋白泵出功能，更深层次分析纳米粒子对MDR发生机制的作用，是纳米粒子对MDR研究在理论上和方法上的新探索

目前在传统肿瘤细胞耐药模型上开展的肿瘤多药耐药（MDR）研究效果并不理想。肿瘤干细胞（CSC）作为产生MDR的根本原因，在MDR研究中显示出重要临床价值。由于CSC高表达耐药蛋白（ABC-transporter proteins）并能将药物或染料泵出从而显示低荧光强度，因此依据异质性肿瘤细胞泵出特异荧光探针如hoechst33342、Rhodamine123(Rh123)的原理能够检测异质性肿瘤细胞（Hoechlow细胞和Rh123low细胞）。纳米粒子的内吞作用、靶向作用等能避免肿瘤细胞耐药蛋白泵出药物，因此纳米粒子可用于MDR研究，而纳米粒子的内吞作用、靶向作用等对异质性肿瘤细胞耐药蛋白药泵机制的影响，以及对以异质性肿瘤细胞为对象的MDR机制作用尚未见报道。因此，我们制备带有Rh123的纳米粒子，应用流式技术开展纳米粒子分离异质性肿瘤细胞实验，考察纳米粒子的特点对异质性肿瘤细胞的影响，从而更深层次分析纳米粒子对MDR发生机制的作用，是纳米粒子对MDR研究在理论上和方法上的新探索。.我们首先构建带有荧光探针Rh123的叶酸受体介导的纳米粒子（Rh123 NPs）。以叶酸受体高表达、中表达和低表达的肿瘤细胞（A2780, OVCAR3和A549）为研究对象。结果表明，Rh123 NPs进入细胞的能力好于单一Rh123，蓄积实验和泵出实验结论也是一样的；并且应用Rh123 NPs分离的Rh123low细胞亚群与Rh123分离的Rh123low细胞亚群有相同的异质性，即细胞处于静息期、有较高的增殖能力，三种细胞亚群均高表达耐药蛋白，表明纳米载体的引入对异质性细胞的性质并没有影响。但是Rh123low细胞的ABC-transporters对药物的摄取没有影响，而对药物的泵出有影响。另外，Rh123 NPs在叶酸受体中表达和高表达的OVCAR3细胞和A2780细胞上分离的Rh123low细胞数量少于Rh123分离的Rh123low细胞数量，而在A549上分离的差别不是很大，可能的原因是纳米粒子的靶向作用、内吞作用促进了更多纳米粒子进入细胞，并且纳米粒子的靶向作用发挥更重要的作用，而纳米粒子可能由于这些作用绕过了Rh123low细胞的泵出，从而显示泵出更少的Rh123low细胞。总体结论，纳米粒子的内吞作用、靶向作用应用于抑制肿瘤的MDR从异质性细胞的角度方面是可行的。