ALI/ARDS肺泡上皮细胞极性损伤启动相关机制研究

肺泡上皮细胞功能障碍是ALI/ARDS早期的主要表现，而肺泡上皮细胞极性损伤是细胞功能障碍的重要起始环节。因此，深入探讨肺泡上皮细胞极性损伤原因很可能阐明ALI/ARDS发病的启动机制。Clathrin在上皮细胞极性调控中扮演必不可少的角色，参与细胞膜电位、离子通道和运输功能调控，但该蛋白的启动和调控机制尚不明确。本研究拟利用Clathrin调控序列为诱饵构建酵母单杂交体系，钓取Clathrin调控基因（Clathrin 调控序列结合蛋白），再通过酵母双杂交、cDNA文库、生物信息学等技术探索LPS与Clathrin调控基因、Clathrin及其相互作用蛋白之间的作用关系，得出Clathrin调控基因在肺泡上皮细胞极性损伤中的作用机制，再利用大鼠模型研究Clathrin调控基因在ALI/ARDS启动机制中的具体作用。这无疑对阐明ALI/ARDS时肺泡上皮功能障碍的启动机制具有重要价值。

肺泡上皮细胞功能障碍是ALI/ARDS早期的主要表现，而肺泡上皮细胞极性损伤是细胞功能障碍的重要起始环节。Clathrin参与细胞膜电位、离子通道和运输功能调控，在上皮细胞极性调控中扮演重要角色，但该蛋白在ALI/ARDS启动和调控机制尚不明确。本课题通过酵母双杂交技术筛选Clathrin相互作用蛋白并免疫共沉淀技术验证，然后利用Clathrin调控序列为诱饵构建酵母单杂交体系，钓取Clathrin调控基因（Clathrin 调控序列结合蛋白）。首先，我们成功分离并利用免疫组织化学、免疫荧光化学鉴定了肺泡II型上皮细胞，检测了Clathrin在LPS致炎的肺泡II型上皮细胞的表达，结果显示在 LPS作用肺泡II型上皮细胞2h、4h两个时相点时，Clathrin表达水平明显下降，提示Clathrin对ALI/ARDS早期肺泡上皮细胞极性损伤调节至关重要。其次，我们通过RNA-seq技术测定了LPS致炎的肺泡II型上皮细胞差异表达基因，如下为差异表达前10位的基因：Gpr84，Batf2，Tmem8c，Gm12250，Pydc4，U90926，Prok2，Elane，Cxcl11，Cxcl3，测序结果表明，ALI/ARDS的发生发展是一多因素参与的复杂过程，包括Clathrin对肺泡上皮细胞极性的调控。酵母双杂交实验结果显示，4种蛋白与Clathrin存在相互作用，分别为：1).adenylate cyclase-associated protein 1 (yeast); 2).filamin, alpha; 3).DAP kinase-related apoptotic kinase 2 (Drak2)/ serine/threonine kinase 17b (apoptosis-inducing) (Stk17b); 4).G protein-coupled receptor kinase 6 (Grk6), transcript variant 1, mRNA。然后通过Co-IP技术证实Clathrin与Drak2体内存在相互作用。Drak2与细胞凋亡密切相关，Clathrin通过Drak2调控细胞凋亡和极性损伤的具体机制将在后续实验中进一步探索。酵母单杂交筛选出5种Clathrin 调控序列结合蛋白，分别为：1).serrate RNA effector mo