Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中作用机制的研究

CDC14A is a serine/threonine dual-specificity phosphatase that reduces CDK1 activity and reverses CDK1(Cyclin dependent kinases)-dependent phosphorylation events. In fission yeast, the Cdc14 regulates the stability of the Cdc25 at the end of mitosis to ensure Cdk1 inactivation before cytokinesis. Human Cdc14A can downregulates Cdc25B activity at the G2/M transition to prevent premature activation of Cdc2 and untimely entry into mitosis. Little is know about whether exist Cdc14A phosphatase and whether Cdc14A play a regulatory role in the G2/M transition period of mouse one-cell fertilized eggs. To test the role and function of Cdc14A phosphatase in G2 arrest of mouse one-cell fertilized eggs, our previous studies demonstrated that Cdc14A was present in mouse one-cell fertilized eggs (G1,S,G2,M phase) by RT-PCR and Western blotting. Moreover, we construct expressive vector of Cdc14A and try to explore the molecular mechanism of G2/M transition of mouse one-cell fertilized eggs by overexpression and knockdown of Cdc14A. It will be of great importance for the study of mechanisms regulating the early fertilized eggs development of human and other mammals.

细胞分裂周期14A蛋白(Cdc14A)是一种丝氨酸/苏氨酸双特异性磷酸酶,能够降低细胞周期素依赖激酶1(Cdk1)的活性,逆转依赖Cdk1(Cdc2)的磷酸化事件。在裂殖酵母，Cdc14在有丝分裂末期调节Cdc25的稳定性，以确保在胞质分裂前钝化Cdk1的活性。人的Cdc14A在G2/M过渡时，下调Cdc25B的活性以阻止提前激活Cdc2，避免细胞过早地进入有丝分裂。小鼠一细胞期受精卵是否表达Cdc14A以及在G2/M过渡期是否具有调控作用,迄今国内外未见报道。为了验证Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2期阻滞中的作用，本研究以小鼠一细胞期受精卵为研究对象，通过RT-PCR和免疫印迹实验证实确实存在Cdc14A。通过过表达Cdc14A和Cdc14A的干涉实验探讨Cdc14A调控小鼠一细胞期受精卵G2/M转变的分子机制，为哺乳动物受精卵早期发育的机理研究提供实验依据。

本课题以小鼠一细胞期受精卵作为研究对象，研究Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2期阻滞中的作用。本课题通过构建Cdc14A和Cdc25B表达载体，在体外转录成mRNA，利用显微注射技术，观察单独注射Cdc14A（活性型、失活型）、共注射Cdc14A和Cdc25B（突变型和野生型）对小鼠一细胞期受精卵G2/M转化的影响，我们的研究证实：（1）在小鼠一细胞期受精卵中Cdc14A和Cdc14B都有表达，Cdc14A、Cdc14B从G1到S期表达下降，从S期到G2期表达量增加，到G2期达到峰值，在M期表达量又下降。（2）细胞免疫荧光实验证实Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G1、S和G2期定位于细胞核，在M期Cdc14A从细胞核中释放并扩散到整个细胞质。（3）过表达 Cdc14A-WT，小鼠一细胞期受精卵延迟进入 M 期；Cdc14A-C278S对小鼠一细胞期受精卵 G2/M 期过渡没有影响。（4）Cdc25B（WT)与Cdc25B（S186A、S15D ）具有相同或相似的活性，能使小鼠一细胞期受精卵卵裂提前，加速 G2/M 期的转换；Cdc25B-S15A 的第 15 位丝氨酸突变成丙氨酸而不能磷酸化而失活，对G2/M 期转换没有影响。（5）敲低Cdc14A后，小鼠一细胞期受精卵加速进入M期，（6）Cdc25B的第15位丝氨酸是Cdc14A与Cdc25B的结合位点。Cdc14A可以与Cdc25B-WT和具有模拟磷酸化作用的Cdc25B-S15D结合，而不与不能磷酸化的Cdc25B-S15A结合。（7）小鼠一细胞期受精卵中 Cdc14A和Cdc25B可能存在相互作用，相互作用的具体位点是 Cdc25B-S15，而不是Cdc25B-S186。（8）Cdc14A能使Cdc25B 的第 15 位丝氨酸脱磷酸化而失活，小鼠一细胞期受精卵阻滞于 G2/M 期。因此认为 Cdc14A是小鼠受精卵早期发育的一个负性调控因子。