利用富勒烯纳米颗粒干扰小鼠肝癌细胞表面FasL/Fas蛋白表达的研究

本课题在利用纳米颗粒[Gd@C82(OH)22]n抑制肿瘤的基础上，利用肿瘤细胞和淋巴细胞表面的FasL/Fas蛋白表达的变化来探讨纳米颗粒对两者之间相互作用的影响。体内动态监测纳米颗粒对正常鼠和荷H22瘤鼠体内FasL蛋白表达以及T细胞亚型的变化，考察纳米颗粒影响两者随时间变化的规律;研究纳米颗粒对巨噬细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞的免疫激活调控机制，结合利用实体瘤内特异性的肿瘤浸润性淋巴细胞的分离和培养，揭示纳米颗粒对特异性和非特异性免疫细胞的免疫活性调控和肿瘤细胞增殖抑制的免疫治疗机理，从而探讨这一机制在维持纳米颗粒的生物活性，对恶性实体瘤有效抑制的生物学意义，为纳米颗粒应用于肿瘤免疫治疗的临床提供有价值的试验结论和理论参考。

本研究在动物、细胞和分子水平检测肿瘤细胞和淋巴细胞表面的Fas/FasL 基因、蛋白表达的变化来探讨纳米颗粒对两者之间相互作用的影响。考察了动物体内纳米颗粒和肿瘤因素所引起的免疫系统的变化。研究了纳米颗粒对巨噬细胞、T淋巴细胞和肿瘤细胞功能的影响。重点探讨了纳米颗粒对巨噬细胞和肿瘤细胞表面Fas/FasL基因表达的影响。建立了细胞因子诱导的脾淋巴细胞培养体系及作用效果评价体系。主要取得了以下研究成果：.1、通过动物水平的研究，我们发现肿瘤因素会降低小鼠脾脏CD4+T细胞的比例，而且使脾淋巴细胞FasL表达下调，Fas表达上调，这是形成肿瘤免疫逃逸的重要机制。.2、[Gd@C82(OH)22]n和羧基化碳纳米管这两种纳米材料均有抑瘤作用。与顺铂不同是，它们的抑瘤作用在一定程度上依赖免疫机制。这种依赖主要体现在以下几个方面：一是[Gd@C82(OH)22]n和羧基化碳纳米管均能显著提高脾脏淋巴细胞CD4+T细胞的比例；二是羧基化碳纳米管可以促进小鼠脾淋巴细胞FasL表达，并抑制其Fas的表达；三是羧基化碳纳米管能够促进巨噬细胞分泌TNF-α因子。值得注意的是，上述三种作用在荷瘤鼠中表现的更为显著，说明纳米颗粒对机体免疫能力的提升具有肿瘤特异性。对正常鼠而言，这种增强免疫的作用并不显著。.3、体外细胞实验证实，羧基化碳纳米管一方面能使巨噬细胞RAW的FasL表达上调，并抑制其Fas表达，使RAW识别肿瘤细胞能力增强，被肿瘤细胞识别反杀伤的机会减少。另一方面，羧基化碳纳米管能够增强肿瘤细胞Fas基因的表达和抑制FasL基因表达，提高小鼠肿瘤细胞B16对免疫细胞的敏感性。这两方面的作用，可以共同强化羧基化碳纳米管对肿瘤免疫治疗的效果。.4、纳米颗粒对小鼠内脏器官不存在结构性损伤效应，荷瘤鼠内脏器官与正常鼠比较未发现显著变化。研究中发现，碳纳米管在小鼠肺部有少量沉积，但在肝脏和脾脏未发现羧基化碳纳米管的沉积。这提示羧基化碳纳米管在动物体内的代谢清除存在一定的延迟效应。.5、建立了细胞因子诱导的脾淋巴细胞培养体系并对B16细胞进行了细胞毒性检测，结果表明，细胞因子诱导的脾淋巴细胞能显著提高对B16细胞的杀伤效果。本研究手段能为后继探讨纳米颗粒对脾淋巴细胞功能的影响提供支撑。