牙鲆多聚免疫球蛋白受体(pIgR)在黏膜免疫球蛋白转运过程中的作用研究

Polymeric immunoglobulin receptor (pIgR) is a key factor of mucosal immune system, which can transport polymeric immunoglobulins (pIgs) through the epithelial cells into the mucosal secretions to protect the organisms from infection. With the further research on mucosal immunoglobulins in fish, the functional roles of pIgR and the transport pathway and transport mechanism of pIgs mediated by pIgR have become worldwide research focus. In previous researches we have got the gene and amino acid sequences of pIgR, the recombinant pIgR protein and rabbit anti-pIgR antibody of Flounder Paralichthys olivaceus. Based on these results, this project is planning to detect the tissue distribution and abundance changes of IgM and IgT producing cells, and pIgR in the systemic and mucosal tissues of P. olivaceus by using the anti-serum IgM, anti-mucus IgM and anti-pIgR, as well as anti-IgT as probe; analysis the dynamics of pIgR expression and the immune response of secretory IgM and IgT after immunization with inactivated Vibrio anguillarum, shedding light on the relationship between them; following the study about the express regulation of pIgR in gene mRNA and protein level induced by pathogen and cytokine including INF-γ、TNF、IL-1 and IL-4, the epithelial transcytosis of IgM and IgT mediated by the pIgR in vivo and in vitro will be investigated, including the courses of the binding of ploymeric IgM and IgT to the pIgR，receptor-mediated endocytosis, transported through a series of intracellular vesicles, and pIgR proteolytically cleaved to SC at the mucosal surface and in external secretions free SC and secretory IgM and IgT contribute to nrutralization, to better understand the transport pathway. The predicted results of this project will benefit the exploring of transport machanism of pIgs and providing the basis data for the researches on the mucosal immunity.

鱼类多聚免疫球蛋白受体（pIgR）是黏膜免疫系统的关键因子，能够介导多聚免疫球蛋白(pIgs)转运进入黏膜分泌物发挥免疫防御作用，pIgR研究及黏膜免疫球蛋白的转运途径和机制问题已成为热点。本项目在已获得牙鲆pIgR基因和氨基酸序列、重组蛋白和兔抗pIgR抗体的基础上，开展牙鲆pIgR在黏膜免疫球蛋白转运中的作用研究。利用抗牙鲆血清和黏液IgM抗体、pIgR抗体及IgT抗体为探针，研究牙鲆免疫后黏膜IgM、IgT产生细胞及pIgR的组织分布及丰度变化；检测pIgR及黏膜免疫球蛋白的应答动态变化，分析pIgR表达与黏膜抗体应答的关系；研究病原和细胞因子对pIgR的表达调节；在牙鲆体内和细胞水平上研究pIgR与黏膜pIgs的结合、内化、细胞内转运及释放的转胞吞作用过程,以及黏膜免疫球蛋白的肝胆运输，探明牙鲆黏膜免疫球球蛋白的转运途径；为进一步研究鱼类黏膜免疫球蛋白转运机制和黏膜免疫提供资料。

鱼类黏膜免疫系统作为抵抗微生物入侵的第一道防线，相比于陆生脊椎动物的黏膜免疫系统具有更重要的作用。鱼类多聚免疫球蛋白受体（pIgR）是黏膜免疫系统的关键因子，介导多聚免疫球蛋白(pIgs)转运进入黏膜分泌物发挥免疫防御功能。基金项目（31472295）在已获得牙鲆pIgR 基因序列和抗pIgR抗体的基础上，克隆分析了牙鲆膜结合型和分泌型IgT基因，制备了抗牙鲆IgT单抗，研究了IgM+、IgT+细胞以及pIgR在牙鲆组织中的分布，分析了注射/浸泡感染和免疫后IgT、IgM和pIgR的应答规律，以及在黏液和胆汁中蛋白水平变化，确定其在黏液及胆汁中以pIgR-IgM复合物存在，解析了pIgR 表达与黏膜Igs免疫应答的关系。分析了浸泡和注射免疫后细胞因子IFN γ、TNF α和IL-1β基因表达变化，发现细胞因子TNF-α重组蛋白可以上调FG细胞中pIgR基因和蛋白表达，而抑制剂LY-294002抑制TNF-α 可以抑制pIgR的上调，确定TNF-α对pIgR表达的上调作用通过PI3K和NF-κB信号通路起作用，揭示了病原和细胞因子对pIgR的调节作用。构建牙鲆pIgR真核表达载体，获得稳定转染pIgR的MDCK细胞，体外细胞水平上研究了牙鲆pIgR介导IgM转胞吞作用，探明了pIgR介导黏膜IgM跨上皮细胞转运过程。研究了牙鲆肠和鳃中pIgR介导黏膜IgM-抗原复合物的免疫清除过程，首次发现鱼类和哺乳动物一样具有黏膜免疫清除系统，在pIgR介导下快速转运IgM-抗原复合物到体表黏液，从而保持黏膜免疫稳态。研究了黏液细胞数量与黏液素性质、黏液糖蛋白量、糖基化水平和模式在疫苗免疫后的时序变化，以及MUC5AC、MUC2基因的免疫应答变化，发现在病原感染/疫苗免疫后，黏液分泌量增加，黏液素成分由中性向酸性转变，为阐释鱼类黏液细胞与黏液的黏膜防御功能奠定了基础。克隆表达分析了一种牙鲆pIgR类似物 (pIgRL)，研究了灭活鳗弧菌免疫后pIgRL基因应答动态，制备了抗牙鲆pIgRL抗体，发现黏液中存在pIgRL-IgM复合物，提示牙鲆pIgRL可能与pIgR一样具有转运IgM的功能。项目成果为深入研究鱼类黏膜免疫系统以及黏液细胞和黏液在黏膜免疫中的功能奠定了基础，也为新型黏膜疫苗的研发与高效应用提供了资料，具有重要的学术价值和科学意义。