登革病毒prM蛋白ADE表位的发现及其缺陷型疫苗株的构建

Antibody dependent enhancement (ADE) infection of dengue virus (DENV) has been considered the major determinant for the pathogenesis of severe dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, which significantly restricts the development of DENV vaccine. Recent findings have demonstrated the significance of anti-prM antibodies during ADE infection by interacting with the immature DENV particles. However, the specific epitopes in the prM protein responsible for the ADE activity remains elusive. In this proposal, we sought to map the major B-cell epitopes in the prM protein of DENV by using computer analysis, surface display, peptide synthesis and screening, and characterize the antibody repertoire induced by these epitopes, and identify the specific epitopes and critical amino acids responsible for the ADE activities by using in vitro and in vivo ADE assays. Then, based on sequence aligment and immature virion structure remodel, a series of mutations will be introduced into the infectious clone of an attenuated DENV strain to reconstruct or change the above mentioned ADE epitopes in the prM protein. The rescued mutant DENV will be further characterized by standard biochemical and virological assays, and full genome sequencing and ADE assays will be performed to confirm the abolishment of ADE activity. Finally, the identified recombinant DENV with reconstructed ADE epitopes will be used to immunize mice, and the immunogenicity and ADE potentials will be evaluated. Our study will for the first time identify the specific ADE epitopes in the prM protein of DENV, and develop the ADE epitope-defective DENV vaccine candidates by reverse genetics. These findings will not only help to understand the pathogeneses of DENV infection, but also are of critical importance for the rational design of tetravalent DENV vaccine in the future.

抗体依赖性感染增强作用（ADE）在登革病毒的致病机制中发挥重要作用，是制约登革热疫苗研发的主要瓶颈。最近的研究表明，prM蛋白参与未成熟登革病毒颗粒的加工过程，是影响ADE效应的重要因素。本研究从登革病毒prM蛋白的B细胞表位入手，通过计算机预测、多肽合成、表面展示等方法进行精细表位作图，在体内外模型中分析其诱导抗体的生物学效应，发现和鉴定prM蛋白中特异的ADE表位；进一步根据计算机预测结果对上述ADE表位进行模拟改构，并利用反向遗传学技术将一系列突变引入登革病毒减毒株的感染性全长cDNA克隆，从而构建ADE表位缺陷型重组登革病毒减毒株；经免疫荧光、蚀斑、一步生长曲线等鉴定后，结合体内外ADE分析证实表位改造对重组病毒ADE活性的影响；最后在动物模型中评价上述重组病毒的免疫效果与ADE风险。本研究的开展将能够发现登革病毒prM蛋白特异的ADE表位，为登革热四价疫苗的理性设计提供新的思路。

本项目的研究计划包括从登革病毒prM蛋白的B细胞表位入手，通过计算机预测、多肽合成、表面展示等方法进行精细表位作图，在体内外模型中分析其诱导抗体的生物学效应，发现和鉴定prM蛋白中特异的ADE表位；进一步根据计算机预测结果对上述ADE表位进行模拟改构，并利用反向遗传学技术将一系列突变引入登革病毒减毒株的感染性全长cDNA克隆，从而构建ADE表位缺陷型重组登革病毒减毒株；经免疫荧光、蚀斑、一步生长曲线等鉴定后，结合体内外ADE分析证实表位改造对重组病毒ADE活性的影响；最后在动物模型中评价上述重组病毒的免疫效果与ADE风险。. 本项目按计划开展了研究工作，基本完成预定的研究目标，取得了以下重要的研究结果：1）证实了登革prM抗体具有感染增强作用，同时采用多手段精细作图，鉴定了多个prM蛋白中特异的ADE表位，并分析了这些ADE表位的结构与功能，为下一步合理设计ADE表位缺陷型疫苗株提供了重要的理论依据。2）利用反向遗传学技术，特异地对相应ADE表位进行定点突变，成功构建了一系列ADE表位缺陷型重组登革病毒株，体内外实验证实诱导产生的抗体在体外具有良好的中和活性，而不产生ADE活性，上述结果为相应疫苗进入临床研究阶段奠定了重要基础。. 在本项目的资助下，先后在病毒学主流杂志J Virol等发表SCI论文18篇，在2014年广州登革热大流行期间出版了《登革热防治手册》，《登革热的临床与基础研究》获得广州科技进步一等奖，参与制定了《登革热的诊断标准》。在项目实施过程中，项目负责人的科研能力得到了充分的锻炼，研究水平也得到了很大提高，2014年获得总后科技新星，2015年获得国家自然科学基金优青项目资助，2016年晋升研究员，并获得英国医学科学院和自然科学基金委的“牛顿高级学者”资助。目前兼任《BMC Infectious Diseases》，《Scientific Reports》、《npj Vaccines》等国际期刊编委。