HuN4株HPPRRSV感染SPF猪早期PAM相关miRNA的筛选与功能分析

猪是重要的经济动物和理想的医学实验动物模型。高致病性猪蓝耳病（HPPRRS）是一种异常天然免疫应答性呼吸道RNA病毒病，其病原（HPPRRSV）专嗜猪肺泡巨噬细胞（PAM）并造成严重损伤，相关分子病理机制尚未阐明。本项目以HuN4株HPPRRSV感染SPF猪的PAM为研究模型，采用miRNA芯片技术分析、测定SPF猪感染早期PAM中miRNA的表达谱，筛选HPPRRSV感染早期表达差异的miRNA（P≤0.01），预测其在猪基因组和病毒基因上的靶标，确定靶位点，绘制HPPRRSV感染PAM早期miRNA-mRNA相互作用网络；在细胞水平运用过表达技术分析miRNA对病毒感染的影响，阐明miRNA调控病毒感染的分子机制，试图揭示HPPRRSV对PAM嗜性及严重损伤的miRNA分子基础。本项目的完成对HPPRRS的防治具有实际指导意义，对类似RNA病毒病的免疫病理机制研究可提供重要的理论基础。

本研究探索了高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒HuN4株感染猪肺泡巨噬细胞（PAM）后宿主miRNA的变化，并对差异表达miRNA进行验证，功能分析，靶标分析等，以找到PRRSV感染过程中的关键miRNA分子。为了增加miRNA的数目，我们首先利用生物信息学方法对PRRSV编码的miRNA进行预测和验证。研究发现，所有8株PRRSV序列都有满足miRNA序列特征的片段，但是这些片段都定位在基因组的蛋白编码区内。我们对miRBase19里面所有的病毒编码miRNA做了分析，发现所有的miRNA都定在病毒基因的内含子区或非编码区内。我们采集PAM 感染HuN4后6h，12h,24h的RNA样品进行猪miRNA芯片分析。结果显示PAM 感染HuN4后各个时间点均有miRNA的表达发生变化。此后，我们又对差异表达的miRNA在PRRSV基因组和猪基因组内分别进行靶标预测和分析。结果显示，病毒基因组内差异miRNA的靶标集中在RNA复制酶和转录相关蛋白，证明差异表达miRNA的功能可能与病毒复制有关。对差异表达miRNA靶标进行GO功能富集分析，结果显示动物体内，靶标的功能主要集中在转录、代谢、信号转导、细胞增殖、凋亡以及免疫反应和炎症反应。信号通路分析发现，在PRRSV的感染过程中发挥着重要的作用的Notch signaling pathway，MAPK signaling pathway， p53 signaling pathway，Apoptosis，TGF-β signaling pathway和TLR signaling pathway等，其关键分子均为miRNA的靶标。同时，我们也进行了甲型H1N1流感病毒感染仔猪肺泡巨噬细胞差异miRNA的调控网络构建与分析，以和我们的结果进行比较。