番茄果实成熟衰老中NAC转录因子与乙烯合成、信号传导相关蛋白的互作机制研究

NAC transcription factors play important roles in plant development and resistance. While ethylene is an important conditioning factor in the ripening and senescence of tomato (climacteric fruit). Basic our research results, silencing NAC genes significantly affects ethylene synthesis and the expression of signal transduction related genes, yet its molecular mechanism remains unclear now. By experimental methods such as chromatin immuno coprecipitation(ChIP), gel retardation assay, yeast two-hybrid system, BiFC and pull-down, the project determines the interaction between NAC and signal transduction related genes in ethylene synthesis (LeACS2/LeACS4 /LeETRs/LeCTRs/ LeEIN2/LeEILs/ LeERFs) in two aspects of protein-DNA and protein-protein interactions in vivo or vitro. The destination is to find the target gene and promoter sequence of NAC, determine the interactions between NAC and RIN proteins, analyze the coordinating relations between NAC transcription factors and ethylene in metabolism in tomato fruit ripening and senescence, and establish transcriptional regulatory network based on ethylene-NAC-RIN, thus providing new theoretical support for illuminating roles of different transcription factors and proteins interactions in the regulatory network of tomato ripening and senescence.

NAC转录因子在调控植物生长发育和逆境胁迫应答过程中发挥重要的作用，而乙烯是调控跃变型果实番茄成熟衰老的重要因子，前期研究发现沉默NAC基因番茄果实乙烯合成和信号传导相关基因表达模式受到显著影响，其分子作用机制尚不清楚。项目通过染色质免疫共沉淀、凝胶阻滞、酵母双杂交、BiFC以及pull-down等实验方法，鉴定NAC直接调控的靶基因和这些基因的启动子序列，初步从体内和体外，在蛋白-DNA层面分析NAC与乙烯合成信号传导相关基因（LeACS2/LeACS4等）的关系，解析NAC转录因子与乙烯在番茄果实成熟衰老代谢中的协调关系，为进一步阐明NAC转录因子在调控番茄果实成熟衰老的代谢网络中的作用提供新的理论支撑。

项目利用生物信息学方法分析番茄NAC转录因子的高级结构和乙烯关键基因转录结合位点。通过构建NAC蛋白表达载体，表达纯化NAC 蛋白，分析NAC与乙烯之间的互作关系，转录组分析NAC调控的下游基因，为深入揭示NAC与乙烯协同调控果实成熟的机制提供依据。 .（1）生物信息学分析：对SNAC4-9转录因子蛋白的高级结构和生物调控功能预测，SNAC4和SNAC6与拟南芥ANAC056相近；SNAC5和SNAC8与拟南芥ANAC072最相近；SNAC7和SNAC9与拟南芥ANAC029最相近。SNAC4-9转录因子还可能参与调控生长素、脱落酸、茉莉酸等植物激素的信号转导途经。分析乙烯合成和信号转导相关基因LeACS4、LeACO1、NR、LeETR4、LeCTR1、LeERF2的启动子序列进行转录因子结合位点预测。.（2）成功构建原核表达载体pET-SNAC4/5/7/8/9，利用IPTG诱导表达重组蛋白后发现，SNAC4/7/8/9主要以包涵体蛋白的形式存在，SNAC5则主要以可溶性蛋白的形式存在。.（3）选择最优方案表达SNAC4/9蛋白，利用Ni柱亲和层析纯化SNAC4/9蛋白，同时采用切胶纯化目的蛋白的方案纯化SNAC4/9蛋白，然后对纯化的SNAC4/9蛋白进行复性，结果表明两种方案均获得纯度较高的目的蛋白。.（4）通过凝胶阻滞实验在体外确定SNAC4/9转录因子调控的目的基因。SNAC4转录因子可与LeACS2/LeACS4启动子结合，而SNAC9转录因子可与LeACO1/LeACO4/LeACS2/LeACS4的启动子结合，初步证实SNAC4可直接调控LeACS2/LeACS4，SNAC9可直接调控LeACO1/ LeACO4/ LeACS2/ LeACS4，SNAC4/9转录因子通过调控果实的乙烯生物合成过程而影响番茄果实的成熟。.（5）转录组分析表明：NAC4和NAC9调控下游目的基因包括细胞壁代谢相关的果胶酯酶和纤维素合酶，叶绿素和类黄酮合成基因；ACC合酶，泛素蛋白转移酶等。