胆碱能抗炎通路对鱼类肠黏膜免疫调控及缓解食源性肠炎的机理研究

The enteritis and growth decline caused by substitution of protein in feeds is an important limitation in aquaculture. The regulatory lymphocyte play the key role in the resilience to fish enteritis, and its immune regulation function could be turned on by the cholinergic anti-inflammatory signal. Apart from secretion by neuron, choline synthesized by immune cells could also influence the intestinal immune regulation in LP layer. T/B lymphocytes, macrophages and dendritic cells were found to express AchRs on their surfaces. Moreover, the ligand or agonist of AchR, the inhibitor of AchE, and some microRNA could enhance the cholinergic anti-inflammatory function by both inhibiting acitivation of NKκb and facilitating the immune regulatory function of lymphocytes. Our previous result shows that a typical inhibitor of AchE can prevent soybean induced enteritis in fish, and on the other hand we has identified the possible B regulatory lymphocyte and some related effectors in grass carp. However, the mechanism involved in fish intestinal cholinergic anti-inflammatory pathway is still unknown yet. Therefore, in this project, we will analyze the factors related to intestinal cholinergic anti-inflammatory pathway to reveal the immune regulatory mechanism of fish intestinal cholinergic pathway as well as its remission ability in foodborne enteritis, in order to develop the feed additives or drugs.

水产动物饲料中替代蛋白源引起的肠炎及生长下降是制约行业发展的一个重要问题。调节性淋巴细胞在鱼类肠炎的自愈过程中起关键作用，而胆碱能信号调控是其免疫调控功能的重要开关。除了神经来源的，免疫细胞自身也可合成乙酰胆碱，影响LP层免疫细胞的免疫调节过程。已发现T/B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞都可表达乙酰胆碱受体。乙酰胆碱受体的配体或激动剂、AchE抑制剂、microRNA均可通过提高胆碱能通路的抗炎效应，来抑制NKκb激活，同时促进调节性淋巴细胞的免疫调节功能发挥。我们的前期结果显示：胆碱酯酶抑制剂可预防豆粕引起的鱼类肠炎；在鱼类中初步鉴定到调节性B淋巴细胞，同时对其效应因子也阐明了免疫调节功能。而胆碱能抗炎通路在鱼类肠黏膜免疫中的机理还不清晰。本项目拟从胆碱能抗炎通路相关因子入手，阐明鱼类肠黏膜免疫中胆碱能抗炎通路的免疫调节及其缓解鱼类食源性肠炎的机理和方法，旨在研发有效饲料或药物。

鱼类肠粘膜的免疫调节是缓解食源性肠炎的有效机制，我们的前期研究表明胆碱能抗炎通路在草鱼的豆粕引起肠炎的恢复阶段可能起作用。在本研究中，我们对胆碱能抗炎通路的上游基因构建了斑马鱼敲除突变品系便于后续机理研究；完善了鱼类肠炎建模，采用荧光标记免疫细胞成像技术分析了斑马鱼肠炎的先天和后天免疫细胞炎性聚集；通过草鱼转录组进行药物及其药效靶点基因的预测；利用肠转录组、微生物组、代谢组等多组学数据整合分析方法解释病理和药效机制。形成了一整套鱼类肠黏膜病理和药效分析技术。基于以上技术，揭示了缓解鱼类食源性肠炎的胆碱能抗炎相关的一系列黏膜免疫通路，对其作用机理及起效因子进行了系统的解析。已发现加兰他敏（胆碱酯酶抑制剂）和青藤碱（胆碱受体激动剂）在斑马鱼和草鱼中都具有抗肠黏膜炎症的作用，还发现PPAR通路激活是胆碱能抗炎效果发挥的重要下游因素。通过免疫调节的上游因子SOCS8的研究，揭示了黏膜免疫和糖代谢的交互调控对于抗肠炎的重要意义；而采用预测药物（沙棘及没食子酸）在豆粕诱导肠炎模型中进行的分析揭示了鱼类黏膜免疫和脂代谢互动调节的机理。目前，已找到胆碱能抗炎通路的一系列效应因子（溶酶体、粘液蛋白合成、PPAR通路、T细胞增殖的负调控，淋巴细胞活化和迁移等通路），免疫调节关键基因（如IL13R、IL22R、TLR8、CCL35等），抗炎代谢物（三羟二磷酸、黄芩苷、麦芽糖、磺基茉莉酮酸和厄贝沙坦等），以及益生菌（厚壁菌、疣微菌、醋酸杆菌等）。本项目所开发的方法和药物申请发明专利6项，解析的抗鱼类食源性肠肝炎症的免疫机理已发表论文6篇，为深入研究鱼类食源性肠肝病变及其缓解的免疫调节机理提供了研究基础及方法，也为相关药物或功能添加剂的研发乃至鱼类黏膜抗病育种提供了研究方法和候选因子。