南方根结线虫孤雌生殖毒性微进化种群的基因组变异及其机制

The root-knot nematode is an important and disastrous pest in the vegetables production in China. In this project, based on previously acquisition of ten Mi-1 virulent (micro-evolutionary) and ten mi-1 avirulent (control) near-isogenic lines and completion of genomic resequencing of parthenogenetic M. incognita, we will analyze the experimental evolution of adaptation in the virulence populations of parthenogenetic root-knot nematode, combining with genomics approaches. We will further compare the transcriptomes of these nematodes by RNA-sequencing, to interpret the genomic variation of Mi-1 virulent and avirulent NIL and genetic effects of transposons insertion, and influence on the function of genes, trans- and cis- splice, occurrence of new genes and new promoters. We will search out those strongly divergent gene loci, annotate and identify the key virulence genes against Mi-1 resistance genotype of hosts, and then elucidate the mechanism of micro-evolution of the virulence populations in parthenogenetic M. incognita. The results will provide insight into the evolution process of virulence populations in parthenogenetic root-knot nematode, and provide useful information for developing sustainable control technology.

根结线虫是危害蔬菜的一种重要植物寄生线虫。本项目拟通过南方根结线虫孤雌生殖毒性种群适应性实验进化分析与基因组学工具相结合的途径，在已完成获得的10个Mi-1毒性（微进化）与10个mi-1无毒（参照）拟近等基因系种群基因组深度重测序的基础上，进一步进行高通量RNA-seq分析比较，研究解析Mi-1毒性和mi-1无毒近等基因系种群基因组的变异、转座子插入的遗传效应、以及对基因的功能、顺式和反式剪切、新基因和新启动子形成的影响，从全基因组水平上挖掘出强烈分化的基因位点，注释与验证出适应Mi-1抗线虫基因型的关键毒性基因，从而阐明根结线虫孤雌生殖毒性种群微进化机制。这些研究结果对于丰富根结线虫孤雌生殖种群遗传进化理论和发展持久性遗传控制新技术均具有重要的意义。

通过对根结线虫毒性种群和非毒性种群进行全基因组高通量重测序，及比较基因组分析，我们鉴定了非毒性群体中特有的396 kb基因组片断，该基因组片段共注释了103个基因，其中11个具有信号肽，为可能的效应子基因。通过对毒性和非毒性群体的转录组测序，我们共鉴定了1863差异表达的基因，其中毒性群体533个，非毒性群体1330个。将基因组数据和转录组数据相结合，我们选择Minc00515和Minc10750两个基因为候选基因，并对Minc10750进行了功能验证。Minc10750在线虫的亚腹食道腺中特异表达，Minc10750被沉默时，能够增加非毒性线虫在抗病辣椒的致病性，并且能够特异的激发抗病辣椒上HR反应，这表明其可能作为无毒基因与Me3抗病基因互作。另外，我们鉴定了南方根结线虫Me3毒性种群中特异表达的效应子Minc03867和Minc11785的功能。Minc03867和Minc11785都具有C型凝集素结构域，能够抑制本明烟上由BAX引起的过敏性坏死反应，Minc03867和Minc11785基因沉默能够明显降低Me3毒性线虫对抗病辣椒HDA149的侵染能力，而拟南芥超表达Minc03867基因能够增加其对南方根结线虫的感病性，这证实效应子Minc03867和Minc11785具有免疫抑制作用。我们对南方根结线虫的两个效应子MiISE5和MiISE6的功能进行了研究。MiISE5的功能研究表明，MiISE5在南方根结线虫的亚腹食道腺中特异表达，TRV介导的MiISE5的基因沉默能够使线虫的侵染能力下降，转MiISE5基因拟南芥增加转基因拟南芥的感病性，MiISE5不具有转录激活功能。这说明MiISE5虽然具有C2H2锌指结构域，但它并不进入细胞核发挥功能，可能通过在细胞质中与植物蛋白互作或进行转录后修饰发挥功能。亚细胞定位实验发现MiISE6定位于细胞核中，并且MiISE6在侵染初期上调表达。原位杂交及荧光原位的实验表明，MiISE6在南方根结线虫的亚腹食道腺中特异表达。通过转MiISE6拟南芥，发现转基因株系线虫根结数目明显增加。而拟南芥RNAi突变体株系的线虫根结数目有明显下降，这表明MiISE6能增加拟南芥对线虫的敏感性。