中华鲟GnRH和KiSS/GPR54信号基因的克隆、表达及功能研究

中华鲟是具有溯河产卵习性的大型鱼类，由于人类活动的影响，中华鲟的生存环境持续恶化，物种处于濒危状态。经过20多年的研究，中华鲟自然繁殖生态学、野生亲鱼的人工繁殖和苗种规模化培育技术已渐成熟，但对其生殖调控的遗传基础知之甚少。"下丘脑-垂体-性腺"轴是调节鱼类生殖活动的重要内分泌系统，下丘脑在生殖调控过程中起起始调控的重要作用。本项目拟构建中华鲟下丘脑SMART cDNA 文库，克隆其GnRH和KiSS/GPR54信号基因，运用实时定量PCR和RNA原位杂交等方法揭示所得基因的时空表达特征、运用细胞孵育和注射合成多肽等离体和在体研究方法研究其生殖调控功能及作用机理，初步阐明其生物学功能。由于中华鲟具有独特的进化及生态学地位，本研究的完成将有助于我们了解脊椎动物GnRH和KiSS/GPR54信号的系统进化，同时也为中华鲟性腺发育的神经内分泌调控研究积累数据。

由于人类活动的影响，中华鲟的生存环境恶化，物种资源下降，目前已处于濒危状态。长江所已经实现了中华鲟全人工繁殖，但对其生殖调控机制知之甚少。中华鲟的生殖调控主要由下丘脑-垂体-性腺调控轴来完成，本研究鉴定了中华鲟GnRH、kiss/GPR54、pou2和nanos1等基因，并对其序列、表达特征和生理功能进行了分析。.1. 鉴定AsGnRH1 和AsGnRH2基因，进行了序列和进化分析；组织RT-PCR研究结果表明，AsGnRH1在脾、肝、性腺、垂体、下丘脑和端脑中有表达，而AsGnRH2仅在脑组织中表达。E2埋植能促进未成熟中华鲟垂体和下丘脑中AsGnRH1和 AsGnRH2的表达；暗示E2对GnRH有正反馈调节作用。.2. 鉴定Askiss1、Askiss2及其受体AsGPR54-1、AsGPR54-2基因。组织荧光定量PCR分析发现，Askiss1mRNA只在垂体和下丘脑中有转录，而Askiss2则在下丘脑，端脑，中脑，小脑和延脑中都有转录；AsGPR54-1受体与Askiss2的mRNA组织分布一致，而AsGPR54-2 mRNA在垂体，下丘脑，端脑，中脑，小脑和延脑中都有转录，暗示中华鲟两种Kisspeptin与其受体的结合可能存在功能交叉。.3. 鉴定Aspou2基因，进行序列和进化分析。RT-PCR分析发现，Aspou2 mRNA在脾、心、卵巢、脂肪、肾、肌肉、肠、和脑中有表达；Aspou2为母源表达，且表达量随着胚胎发育逐渐降低；但随着性腺的发育，其表达量增加。暗示Aspou2可能在多能干细胞、胚胎和性腺发育过程中起重要作用。.4.鉴定Asnanos1基因，进行氨基酸序列和进化分析。RT-PCR分析发现，Asnanos1在脾、心、卵巢、肝、肾、肌肉、肠和脑中有表达。原核表达AsNanos1并免疫家兔制备有效的多克隆抗体。Western Blot检测到脾、心、卵巢、肝、肾和脑中有AsNanos1蛋白。免疫荧光定位研究发现AsNanos1定位于在初级卵母细胞和精母细胞的细胞质；随着卵细胞的发育。Nanos1可能在生殖细胞的发育过程中起重要作用。.总之，本研究经费按预算执行完成，克隆鉴定了多个中华鲟生殖发育调控基因，发表SCI收录论文3篇，培养硕士研究生2名；为后续系统的研究中华鲟生殖调控和生殖细胞发育机理及性腺成熟的人工调控提供基础。