2,4-D农药降解菌的基因强化及固定化原位修复功能研究

As the first selective herbicides for commercialisation in the world, the long-term and misuse of 2,4-D has caused serious pollution on soil and water. After applied in crops, the 2,4-D series pesticides will eventually migrate to the soil or water, mainly depending on the microbial degradation. Therefore, to explore the microbial degradation of 2,4-D and its metabolites is an important direction to do research on the pollution control of 2,4-D series pesticides. Immobilized microorganism technology is in the initial stage to apply in soil improvement from pesticides pollution. Basing on establishing a method for 2,4-D residual analysis, this project aims to construct 2,4-D degrading genetic microorganism with gene bioaugmentation, which regarding a plasmid pJP4 as mobile genetic elements. Afterwards, several immobilized microorganism techniques are applied to 2,4-D degrading genetic microorganism, such as adsorption, embedding and crosslinking. Furthermore, the optimized immobilizing conditions, physical and chemical characteristics and the simulated test of different types of soil contaminated by 2,4-D will be researched. The project will provide theoretical and technical support for immobilized bioremediation research of 2,4-D, and provide help for pesticide pollution treatment in China.

作为世界上第一种商品化生产的选择性除草剂，2,4-D的长期大量使用已对我国土壤和水体造成了严重污染。该类除草剂自然条件下主要依赖于微生物降解。因此，探索以微生物降解2,4-D及其降解产物，是2,4-D类除草剂产品污染治理研究的重要方向。微生物固定化技术在农药污染土壤治理中的应用处于起步阶段。本项目以2,4-D降解质粒pJP4作为可移动基因片段，运用基因强化技术构建2,4-D降解基因工程菌，并率先采用吸附、包埋和交联等固定化微生物技术对筛选出的高效2,4-D降解基因工程菌进行固定化，探索固定化最优条件，表征固定化产物的物理化学性能，进行2,4-D土壤原位修复室内模拟试验，为2,4-D的固定化微生物修复研究提供理论和技术支持，同时为我国农药污染的治理提供帮助。

2,4-D的长期大量使用对我国土壤和水体存在严重威胁，微生物的原位生物修复是解决该问题的有效途径。本项目通过长期驯化富集技术，筛选2,4-D高效降解菌，取得了如下研究结果：①目前已经筛选出55种2,4-D降解土著菌，其中有2株细菌（食异戊二烯戈登氏菌Gordonia polyisoprenivorans X14和草酸盐贪铜菌Cupriavidus oxalaticus X32）降解效果较好。菌株X32在3 d内即可将500 mg/L 2,4-D完全降解，表现出极强的降解能力。②菌株X32对2,4-D的耐受浓度最高可达3000 mg/L，优于参比菌株钩虫贪铜菌Cupriavidus necator JMP134，15-35 ℃、pH 6.5-9.5是其适宜培养条件。值得注意的是，在pH高达10.5条件下，菌株X32仍然具有降解活性，表现出较强的耐碱性。③采用包埋法将X32细胞固定化，经扫描电子显微镜观察、孔隙特征分析和红外光谱分析，制备的固定化小球结构稳定，内部疏松多孔，可重复使用次数最高可达5次，而且在重复使用时具有更强的降解能力。④通过全基因组测序，在X32的质粒上鉴定到19个与2,4-D降解相关的tfd基因，可分为3个模块，可能是X32比JMP134降解能力更强以及能够耐受更高浓度2,4-D的原因。tfdA基因和tfdB基因通过基因克隆得到验证，提出了2,4-D降解路径。通过HPLC-MS/MS分析，表明2,4-D被X32完全矿化，几乎没有有毒中间体2,4-二氯苯酚的积累。⑤在菌株X32基因组中鉴定到10个可能与耐碱性相关的基因，包括1个Na+/H+逆向转运蛋白NhaA编码基因。⑥菌株X32能够修复2,4-D污染土壤，通过16S扩增子测序分析得出Cupriavidus成为优势物种，并且能够有效缓解植物（玉米）药害。因此，本项目为苯氧羧酸类除草剂的降解提供了有力的技术支撑，可用于土壤修复，乃至工业废水的处理，具有良好的应用前景。同时，本项目还额外筛选出一株有机腈/氟噻草胺降解菌樊庆生氏红球菌Rhodococcus qingshengii X36，为后续研究奠定了基础。