Myosin XVIIIa调节肌纤维完整性和稳定性的机理研究

Myosin XVIIIa(Myo18a) is the only unconventional myosin with a PDZ domain, its expression and function in vertebrate embryos is not investigated. We found that the two zebrafish homologues of myo18a (myo18aa and myo18ab) are strongly expressed in muscle cells, knockdown of these two genes results in lesions in muscle cells which are much similar as muscular dystrophy. We plan to first describe in detail the expression pattern of myo18aa and myo18ab genes in zebrafish embryo. Functional analyses will be performed using knockdown or knockout approaches in zebrafish to investigate their implication in muscle cell formation, stability and integrity, as well as their relationship with muscluar dystrophy-related proteins. In addition, we will identify the partners of myo18a using yeast two hybrid and co-immunoprecipitation approaches. The function of these myo18a-interacting proteins in embryonic muscle cells will be analyzed in order to understand how myo18a protein complex regulates muscle function. Furthermore, conditional knockout of myo18a in mouse muscle cells will be performed to demonstrate how myo18a function is required for muscle stability and integrity during mammalian development. These analyses should provide a mechanistic insight into the implication of myo18a protein complex in the regulation of muscle function. They should also help to identify other molecules involved in muscular dystrophies, and thus lead to a better understanding of the pathogenesis of these diseases and development of future therapies.

Myosin XVIIIa(Myo18a)是唯一含有PDZ结构域的非常规肌球蛋白，它在各种动物发育过程中的表达图式和作用还不清楚。我们发现斑马鱼的两个Myo18a同源基因(Myo18aa和Myo18ab)主要表达在体节的肌细胞中，初步的功能研究显示抑制它们的功能导致与肌肉萎缩症相似的表型。在此基础上，我们将详细确定这两个基因在斑马鱼发育过程中的表达图式。通过在斑马鱼和小鼠中基因敲除等手段，我们将深入研究这两个基因在肌细胞的形成，结构的稳定性、完整性和功能中的作用，分析它们与肌肉萎缩症相关蛋白的关系。我们还将采取酵母双杂交和免疫共沉淀的方法鉴别与Myo18a相作用的蛋白，并开展对它们的功能研究，确定它们与Myo18a在肌细胞发育过程中相互作用关系。这一研究结果将有助于阐明Myo18a在肌细胞发育和功能中的作用机理，为鉴别参与肌肉萎缩症的新的重要蛋白和将来的药物筛选提供理论基础。

本项目拟利用斑马鱼胚胎为模式动物来研究具有PDZ结构域的非常规肌球蛋白Myosin XVIIIa，或Myo18a, 同源基因在肌细胞中的功能及作用机理。计划开展对斑马鱼中两个Myo18a基因(Myo18aa和Myo18ab)的表达图式和功能的研究，并鉴别与Myo18a的PDZ结构域相结合的蛋白，分析它们如何与Myo18a互作来调节肌纤维的稳定性。至今，我们已经基本完成了该项目中所拟定的各项研究计划，研究成果已经以论文的方式发表在国际杂志上。具体成果如下：.1.详细描述了Myo18aa和Myo18ab在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达图式，首次确定了这两个基因特异的表达在体节的边缘。.2. 我们的功能显示Myo18aa和Myo18ab在调节肌纤维稳定性中起重要作用，首次证明了它们是维持肌纤维稳定性的新基因。.3.首次鉴别出两个与Myo18a的PDZ结构域相结合的新蛋白(p190RhoGEF和Golgin45)，有助于深入了解Myo18a的功能和作用机制。.4.我们进一步研究了Myo18a及其作用蛋白在调节肌纤维稳定性中的相互作用。发现它们共同调节肌细胞中的细胞骨架排列和高尔基体形成，进而影响了肌细胞在细胞外基质上的粘连和融合形成多核的肌纤维。.5.我们利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中得到了Myo18aa和Myo18ab的双突变体，为今后进一步和更方便的研究Myo18a在肌纤维结构稳定性中的作用研究提供基础。.以上研究成果目前共在国际杂志上发表3篇论文，其中包括Elife, J. Genet. Genomics和Scientific Reports。我们还组织了一次具有50人规模的国内会议，增强了科研人员的交流与合作。我们的工作还在全国斑马鱼研究大会上作特邀报告一次，在全国斑马鱼PI大会作报告一次。本项目的实施已培养博士毕业生一人，硕士毕业生2人。有5位研究生参加国内学术会议并获奖。