益气活血方调控缺血再灌注肾损伤肾小管上皮细胞极性修复机制研究

在缺血再灌注肾损害时，肾小管上皮细胞损伤，细胞内微管的崩解，细胞内新合成和再循环利用的膜蛋白定位于细胞膜失败，细胞极性消失，导致肾小管上皮细胞无法正常修复并出现功能障碍。近年来研究发现细胞骨架微管系统ATPase 驱动蛋白家族kinesin对于膜蛋白转运、定位和极性恢复起着重要作用。本研究通过动物实验，观察肾脏缺血-再灌注过程中肾小管上皮细胞损伤-修复的不同阶段和益气活血方干预后转运蛋白NaDC3及ATPase 驱动蛋白kinesin表达分布变化；构建NaDC3转运蛋白和ATPase 驱动蛋白kinesin-2轻链（klc-2）大鼠全长表达质粒，体外双层LLCPK-1细胞培养实验，利用荧光共振能量转移（FRET）技术，观察益气活血方含药血清对缺氧-复氧过程中kinesin-2与NaDC3之间相互作用关系的影响，探讨益气活血方通过调控肾小管上皮细胞极性修复而延缓急性肾损伤的机制。

目的：急性肾功能衰竭（ARF）是临床常见危急重症，已知急性肾功能衰竭主要系肾小管坏死所致，因其病理生理机制复杂，造成ARF高发病率和高病死率。肾小管上皮细胞极性的丧失引起功能改变的生理病理学机制是当前生命科学中肾脏病研究的热点与前沿问题之一。钠依赖性二羧酸转运蛋白1（NaDC1）特异性分布消失、再现、重排可以作为肾小管极性改变的标志物。益气活血方肾华片是解放军总医院自主研究的医院制剂，临床可以有效治疗IgA肾病等，基础研究提示其对缺血再灌注大鼠（IRI）肾损害具有保护作用。本研究深入研究其对IRI大鼠肾小管上皮细胞极性蛋白损伤修复的作用。方法：在体外，建立缺氧/复氧肾小管模型，采用含药血清、NaDC1质粒转染、免疫荧光和生物素化免疫印迹等技术，观察复方肾华片对缺氧/复氧肾小管上皮细胞NaDC1转运蛋白定位变化的影响。在体内，大鼠设立对照组、模型组、黄芪甲苷组和肾华片低、高剂量组，共5组，药物预处理1周，造膜后24、72h，进行血生化、肾脏病理、免疫组化及共聚焦显微镜免疫荧光双染法检查，研究复方肾华片对急性缺血再灌大鼠肾小管Na-K-ATP酶的定位作用。结果：细胞实验显示，肾华含药血清GFP-NaDC1质粒组NaDC1主要分布于胞膜，其余各组NaDC1均匀分布在细胞内。免疫印迹结果显示肾华含药血清GFP-NaDC1质粒组NaDC1顶端分布明显多于基底端，其余各组细胞NaDC1在顶端和基底端分布无明显差异。动物实验：术后24h，模型组大鼠血肌酐、尿素氮显著升高， Na-K-ATP酶阳性小管数量减少、分布区域变宽，分布极性消失。肾华片低、高剂量组血生化、肾脏病理以及Na-K-ATP酶数量和分布改变均轻于模型组和黄芪甲苷组。术后72h，肾华低、高剂量组各项血清及病理学评分均明显好转，Na-K-ATP酶数量和分布改善，明显优于模型组，且疗效呈剂量依赖性。结论：本研究从体内外实验结果显示复方肾华片对RIRI具有肾保护作用，肾华含药血清能有效改善NaDC1分布，促进肾小管功能恢复。整体实验表明，复方肾华片可加速肾小管上皮细胞Na-K-ATPase数量回升，促进肾小管上皮细胞极性恢复，保护肾小管，复方制剂疗效优于黄芪甲苷，并具有剂量依赖性。本系列研究结果阐明了复方肾华片对急性肾损伤保护作用的机制之一，为中药复方应用临床急性肾衰竭救治提供了实验依据。