FTY720干预免疫介导的急性肺损伤/肺纤维化的机制研究

临床无肌炎的皮肌炎（clinically amyopathic dermatomyositis，CADM）是具备皮肌炎特征性皮疹但是无肌炎或肌炎轻微，而以急性肺损伤/弥漫性肺纤维化、进行性呼吸衰竭为突出表现的临床综合征，目前其发病机理不明、死亡率极高、治疗乏术。本研究在前期工作的基础上，试图观察新型免疫抑制剂S1P受体激动剂Fty720对CADM肺损伤动物模型的治疗效应，并进一步探讨其对免疫介导的肺损伤／肺纤维化可能的保护作用机制。试图通过一系列实验明确该机制是否是通过由溶血磷脂酸（LPA）受体向S1P受体活化偏移、减少成纤维细胞募集、抑制免疫效应细胞移行、增强肺血管内皮屏障功能等环节协同实现。本研究可能为CADM合并急性肺损伤／肺纤维化这一疑难危重症提供改善病情药物，其结果亦可能拓展应用于其他的免疫／或非免疫介导的肺损伤／肺纤维化，具有重要的临床意义。

目的：利用博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠动物模型和体外培养的人肺成纤维细胞评价新型免疫抑制剂FTY720对肺纤维化的影响，探讨了FTY720对肺间质炎症、组织损伤和纤维化的影响和可能的作用机制。 方法：应用单次气管内注入博莱霉素的方法建立C57小鼠肺纤维化模型，并通过灌胃给药FTY720 (0.1mg/kg/d)来实现对小鼠肺纤维化的干预，分别于第7，14，21天处死小鼠；对小鼠肺组织进行HE 染色及Masson 染色, 观察各组肺组织病理变化并评估炎症和肺纤维化程度; 免疫组化法动态观察肺组织中TGF-β, α-SMA 的表达；通过Real-time PCR法测定肺组织中细胞因子VEGF, IL-1β, α-SMA , Col1a1mRNA的表达水平，评价FTY720在体内的抗纤维化效应；体外用脂多糖刺激人肺成纤维细胞（HFL1），利用Xcelligence实时监测系统观察FTY720对HFL1细胞增殖的影响；Real-time PCR法检测细胞中TGF-β, IL-6, IL-8, MMP2, TIMP1, VEGF, α-SMA mRNA的表达水平，酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞上清中纤维连结蛋白（FN）的分泌水平，评价FTY720在体外的抗纤维化效应；利用Transwell趋化实验检测FTY720对溶血磷脂酸（LPA）介导的人肺成纤维细胞趋化的影响。结果：HE 染色及Masson 染色显示FTY720干预后小鼠肺纤维化程度较模型组减轻；免疫组化结果肺组织TGF-β、α-SMA阳性表达颗粒较模型组减少； FTY720干预后VEGF, IL-1β，α-SMA ,Col1a1在mRNA水平上表达较模型组下调，且均具统计学意义；体外研究发现FTY720干预后HFL1的增殖和趋化活性下降，细胞上清中分泌的FN蛋白水平降低，TGF-β mRNA表达水平下调, 且具有浓度依赖性，IL-6, IL-8, MMP2, α-SMA mRNA水平也下调，具有统计学意义。结论：1. FTY720对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化具有保护作用，可明显降低肺泡炎、肺泡破坏程度及纤维化程度；2. FTY720的保护作用主要是通过抑制TGF-β, α-SMA, VEGF, IL-1β等纤维化相关因子表达，抑制成纤维细胞增殖和趋化以及细胞外基质沉积而减缓肺纤维化的进程。